ALTERNATIVNO IZREZOVANJE INTRONOV

1. UVOD
Že od samega odkritja zgradbe DNA se je znanstvenikom porajalo vprašanje, kako velik je èloveški genom in koliko je pravzaprav vseh genov, ki vsebujejo informacije, pomembne za razvoj in obstoj naše vrste. Prve ocene so se gibale okoli vrtoglavih 153.000, po konèanem projektu Èloveški genom pa je spoznanje, da nas definira le slabih 25.000 genov, zelo osupljivo, sploh èe se primerjamo z nekaterimi manj kompleksnimi vrstami (koruza – 40.000 genov). Glede na to, da so naše celice sposobne sintetizirati okoli 90.000 razliènih proteinov, ki se razlikujejo med posamezniki in nenazadnje tudi med tkivi v istem organizmu, mora obstajati naèin, kako ta set genov èim bolj ekonomièno uporabiti.
Po mnogih raziskavah se je alternativno izrezovanje intronov iz primarnega zapisa mRNA in sestavljanje preostale informacije gena v konèno, zrelo mRNA izkazalo za pot, ki jo je evolucija izbrala za zelo uèinkovito.

2. OSNOVE
Po klasiènem principu sinteze proteinov se informacija iz gena na molekuli DNA (gen je sestavljen iz kodirajoèih zaporedij ali eksonov in nekodirajoèih zaporedij ali intronov) v jedru najprej prepiše v primarni prepis pre-mRNA. Ta je nato podvržena celiènemu mehanizmu, ki izreže introne in poveže preostale eksone; nastane zrela mRNA. Slednja se s pomoèjo tRNA in rRNA na ribosomih prevede v funkcionalen produkt (protein). Ker pa je število genov neustrezno številu razliènih sintetiziranih proteinov, se je moral skozi evolucijo razviti zelo kompleksen naèin, kako lahko celica iz enega gena (ki pa ga sestavlja veè razliènih eksonov in intronov) sintetizira razliène proteine. (Op.: Konèni produkt ni nujno protein!)
Pri alternativnem izrezovanju intronov gre za to, da se celica odloèi, katere eksone v genu bo uporabila za sintezo doloèenega proteina, saj lahko z izpustitvijo enega ali veèih eksonov ustvari popolnoma drugaèen produkt, prav tako pa lahko uporabi nekatere introne. (Primer: Most je treba pod(p)reti.)




Slika1: Alternativno izrezovanje intronov






Za lažje razumevanje si moramo najprej ogledati zgradbo same mRNA molekule: sestavljena je iz ribonukleotidov, ki so med seboj povezani s fosfodiestrskimi vezmi. Nastane tako, da se potrebna informacija prepiše iz zaporedja na DNA, ki definira gen. Vendar vsi deli te t.i. pre-mRNA kasneje niso prevedeni v protein; nekodirajoèa zaporedja (introne) delimo v štiri skupine: v prvi in drugi skupini so introni, ki imajo sposobnost samoizrezovanja; v tretji skupini so introni, ki jih izezuje poseben kompleks (spliceosome) in jih bomo podrobneje obravnavali; v èetrti skupini pa so tisti, ki za izrezovanje potrebujejo še ATP in endonukleazo.
3. PRINCIP IZREZOVANJA IN ZGRADBA INTRONOV
Pri izrezovanju tretje skupine intronov sodeluje t.i. »spliceosome« (ribonukleoproteinski kompleks za izrezovanje intronov), ki ga sestavljajo specializirani kompleksi iz RNA in proteinov, imenovani snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins). Vsak snRNP vsebuje eno od 100 do 200 nukleotidov dolgo snRNA (small nuclear RNA), ki so oznaèene kot U1, U2, U4, U5 in U6. Naloge ribonukleoproteinskega kompleksa so prepoznavanje zaèetnih in konènih mest intronov, izrezovanje intronov iz pre-mRNA in povezovanje preostalih eksonov.
Na intronih so za pravilno delovanje spliceosomov potrebna doloèena zaporedja, ki jih ti lahko prepoznajo. Na 5 koncu introna se nahaja dinukleotid GU; na 3 koncu pa dinukleotid AG.



Slika2: zgradba pre-mRNA




Seveda pa mora spliceosom dobiti sporoèilo, katere introne mora izrezati in kje. Razvili so se SR proteini (splicing regulatory proteins – proteini, ki uravnavajo izrezovanje), ki se lahko vežejo na kratka nukleotidna zaporedja na eksonih pre-mRNA. Ta eksonska zaporedja, ki pospešijo izrezovanje intronov, se imenujejo ESE (exonic splicing enhancers), saj vezava SR proteinov nanje povzroèi, da se na introne, ki obdajajo ekson, vežejo snRNA in priènejo proces izrezovanja: na 5 konec introna se veže U1, na 3 konec pa U2. Na U1 in U2 se nato vežejo še ostali snRNA (U4, U5 in U6) ter proteini spliceosoma, ki skupaj izrežejo nepotrebni intron.



Slika3: izrezovanje s kompleksom ribonukleo- proteinov




SR protein pa se lahko veže tudi na ESS (exonic splicing suppressor) zaporedje v eksonu, kar zavira izrezovanje. Z vezavo SR proteina je prepreèena vezava snRNA na mesta intronov, ki so tik ob tem eksonu. Tako se skupaj s sosednjima intronoma izreže tudi ekson.





Slika4: vezava SR proteina na ESS mesto
Kako pomembne posledice ima lahko izpustitev eksona, nam prikaže doloèitev spola pri vinski mušici: med izražanjem »sex-lethal« gena se lahko iz pre-mRNA izreže ekson, znaèilen za samce. Dodelana mRNA se prevede v protein, specifièen za samice, ki se lahko veže na vse naslednje pre-mRNA tega gena in zagotavlja, da se tvorijo samo žensko-specifièni proteini. Èe se ekson, specifièen za samce, ne izreže iz pre-mRNA, nastane nefunkcionalna mRNA in poti v celici se usmerijo v tvorbo proteinov, znaèilnih za samce.
Pri programirani smrti celice (apoptozi) ima izrezovanje pomembno vlogo. Iz gena Bcl-x, ki je regulator apoptoze, lahko z alternativnim izrezovanjem nastaneta dva proteina: Bcl-x(L), ki zavira apoptozo, ali Bcl-x(S), ki jo pospešuje.

4. PREDNOSTI ALTERNATIVNEGA IZREZOVANJA
Za prvotne organizme so introni predstavljali le majhen del dednega zapisa (glive imajo okoli 270 nukleotidov dolge introne) in izrezovalni kompleks jih je enostavno odkril in odstranil. Skozi evolucijo pa so se ohranile mnoge mutacije in pomnoževanja neuporabnih informacij, tako da se je moral razviti sistem, ki odkrije uporabne dele (eksone) v množici neuporabnega materiala (intronov). (Povpreèni èloveški gen je dolg 28.000 nukleotidov, od tega je 8,8 eksonov, ki jih prekinja 7.8 intronov. Eksoni so relativno kratki (okoli 120 nukleotidov), introne pa sestavlja od 100 do 100.000 nukleotidov.)
Celoten dedni material mora celica šèititi pred možnimi mutacijami; pri prepisovanju se porabi ogromno energije najprej za sintezo, nato pa za izrezovanje in unièenje nepotrebnih delov; vsak napaèen izrez ali napaèno sestavljanje preostalih delov mRNA ima lahko katastrofalne posledice. Kot primer lahko omenimo družinsko disavtonomijo, kjer mutacija enega nukleotida v genu IKBKAP povzroèi, da je ta alternativno izrezan v živènem tkivu; ker zato primanjkuje normalnega, funkcionalnega proteina, pride do nenormalno razvitega živèevja. Približno 15 mutacij, ki imajo za posledico dedno bolezen, deluje na ravni zorenja pre-mRNA, prav tako mnoga rakava obolenja. Zakaj se je torej ohranil tako zapleten sistem, v katerem lahko pride do ogromno napak
Ena od prednosti je zagotovo manjše število genov z veèimi razliènimi produkti. (En gen v povpreèju kodira 3 razliène mRNA).
Znanstveniki so ugotovili, da genom miši vsebuje skoraj enako število genov kot èloveški genom, tudi razmerji med introni in eksoni ter zaporedji nukleotidov sta presenetljivo podobni; èetrtina alternativno izrezanih eksonov pa je specifièna enim ali drugim, zato lahko sklepamo, da so njihovi produkti odgovorni za evolucijsko razhajanje teh dveh vrst.
Prav tako je del alternativno izrezanih eksonov specifièen za primate in pomeni razmejitev od ostalih sesalcev. Eksoni, znaèilni zanje, izvirajo predvsem iz mobilnih elementov, imenovanih Alu (pripadajo razredu retrotranspozonov – kratkih zaporedij, ki se replicirajo in vgrajujejo svoje kopije na poljubna mesta v genomu). Alu zaporedja so dolga okoli 300 nukleotidov in imajo poli-A konec; naš genom že vsebuje okoli 1,4 milijonov njihovih kopij, še vedno pa se na vsakih 100 do 200 rojstev katera od njih vgradi na novo. Približno 5 naših eksonov vsebuje Alu zaporedja: Alu element se je lahko vgradil v intron (ki bi se sicer izrezal in to ne bi imelo posledic), kasneje pa je preko razliènih mutacij vplival na izraznost introna in ga spremenil v kodirajoèi ekson. Èe je novi Alu ekson lahko alternativno izražen, celica še vedno koristi stari produkt, hkrati pa pridobi nov protein. Do problema pride, èe zaradi nove mutacije celica starega proteina ne more veè sintetizirati: to vodi v razliène genske bolezni (npr. Alportov in Slyev sindrom). Raziskave so pokazale, da lahko približno 250.000 Alu zaporedij v genomu mutira le v enem nukleotidu in tako introne spremeni v eksone.



5. RNA TERAPIJA
Ena od možnih rešitev za mnoge genske bolezni je sinteza kratkega zaporedja RNA ali DNA nukleotidov (antisense oligonucleotides), ki bi se vezali na toèno doloèeno zaporedje na DNA ali RNA in tako prekrili mesto, kjer sicer poteka izrezovanje, ali katero drugo regulatorno zaporedje. Postopek je bil najprej uporabljen na krvnih progenitornih celicah bolnikov z beta talasemijo.
Prav tako je bil uspešen v kulturi rakavih celic: s prekritjem 5 izrezovalnega mesta Bcl-x gena, ki regulira apoptozo, je celica zaèela namesto Bcl-x(L) proizvajati Bcl-x(S) mRNA; posledièno je nastajalo veè proapoptotskega proteina, zato je bila celica bolj podvržena kemoterapevtskim sredstvom ali pa je celo unièila samo sebe.
Druga možnost je spodbuditev celice, da v zrelo mRNA vgradi ekson, ki bi ga sicer izrezala iz pre-mRNA: umetno se sintetizira molekulo, ki se lahko veže na doloèeno zaporedje na RNA, nato pa se ji doda del SR-proteina; tako lahko usmeri izrezovalni mehanizem na željena mesta. Tehniko so uporabili v kulturi celic z mutiranimi oblikami gena BRCA1, ki povzoèa raka na prsih, in na mutiranem genu SMN2, ki je vzrok spinalne mišiène atrofije.
Tretja oblika temelji na združitvi dveh razliènih pre-mRNA molekul iz istega gena s spliceosomom (trans-splicing): mutirano regijo pre-mRNA bi lahko izrezali in jo nadomestili z normalnim zaporedjem.V kulturi so tako lahko delno popravili pre-mRNA CFTR gena, ki je odgovoren za razvoj cistiène fibroze.

6. POVZETEK
• Pri alternativnem izrezovanju poteka kombiniranje razliènih eksonov istega gena in pridobivanje veèih razliènih produktov iz enega zapisa.
• Pomemben je ribonukleoproteinski kompleks za izrezovanje (spliceosome), ki ga sestavljajo proteini in RNA molekule. Ko posebni SR proteini prepoznajo tarèno mesto na eksonih (ESE, ESS), kompleks za izrezovanje odstrani nepotrebne dele pre-mRNA, preostale pa sestavi skupaj in nastane željeni produkt.
• Zaradi zahtevnosti reakcij so možne mnoge napake, vendar so koristi alternativnega izrezovanja veèje: kombinacije omogoèajo veè razliènih produktov iz iste osnove (pre-mRNA); evolucijsko so pomembna Alu zaporedja, ki so po mutaciji neaktivne introne spremenila v eksone, zato so se ti vkljuèili v procesirano mRNA, ter tako ustvarile nove proteine.
• Vsak dan se odkrivajo nove možnosti zdravljenja s pomoèjo RNA: možna je sinteza oligonukleotidov, ki zakrijejo regulatorna zaporedja; lahko se umetno sintetizira molekulo, ki usmeri kompleks za izrezovanje na druga mesta; mutirano regijo lahko zamenja normalno zaporedje, èe se združita dve pre-mRNA.

7. LITERATURA
• Ast, G.: The Alternative Genome. Scientific American, april 2005. Str. 42 – 47.
• Nelson, D.; Cox, M.: Lehninger Principles of Biochemistry. New York, W. H. Freeman and Company, 2005.
• Slika1: http://www.pitt.edu/~biohome/Dept/Img/graphics/grabowski/altsplice.jpg (16.10.2005)
• Slike 2 – 3: Ast, G.: The Alternative Genome. Scientific American, april 2005. Str. 42-47.