PROTEINI KRVNE PLAZME

Če preprečimo strjevanje krvi in iz nje s centrifugacijo odstranimo celice, dobimo krvno plazmo. Kadar pa pustimo kri, da se najprej strdi ter šele potem centrifugiramo, dobimo krvni serum, ki se od plazme razlikuje predvsem po odsotnosti fibrinogena.

BIOKEMIJA PLAZEMSKIH PROTEINOV

Za karakterizacijo plazemskih proteinov se največ uporablja elektroforeza krvnega seruma. S to metodo ločimo različno nabite in velike molekule. Elektroforeza poteka na primernem nosilcu (agarozni gel, acetatna celuloza) s pomočjo električnega toka. Uporabljamo alkalen medij, da so proteini prisotni v obliki anionov in tako potujejo proti anodi. Po končanem postopku gel obarvamo, da beljakovine postanejo vidne kot različno intenzivno obravane proge v skladu z njihovo količino. Glede na optično gostoto prog izdelamo denzitogram. Razmerje med ploščino pod zobcem, ki predstavlja določeno frakcijo, in ploščino pod celotno denzitometrično krivuljo predstavlja delež določene frakcije glede na celotno količino beljakovin. S poznavanjem tega deleža in koncentracije beljakovin v serumu lahko izračunamo približno koncentracijo določene frakcije.
Dobimo pet glavnih frakcij:

• Albumin predstavlja 55 do 60 vseh plazemskih proteinov. Pripada skupini plazemskih proteinov z relativno majhno molsko maso (65000). Njegovi najpomembnejši funkciji sta vzdrževanje koloidno-osmotskega pritiska in transport različnih nizkomolekularnih snovi. Sinteza albumina v jetrih je odvisna od onkotskega tlaka (pri znižanem tlaku je pospešena sinteza in obratno). Dnevna razgradnja je pogojena z zalogo albumina: pri visoki je razgradnja pospešena, pri nizki pa upočasnjena.

• Proteini frakcije α1
o α1-lipoprotein predstavlja znaten del frakcije in prenaša lipide
o α1-antitripsin je proteinazni inhibitor
Slika 1. Normalni denzitogram seruma
o kisli α1-glikoprotein je nizkomolekularni protein z visoko koncentracijo ogljikovih hidratov (okroglo 40). Fiziološka funkcija ni znana

• Proteini frakcije α2
o haptoglobin služi vezavi hemoglobina, ki izstopa iz poškodovanih eritrocitov. Kompleks haptoglobin-hemoglobin poleg tega učinkuje tudi kot peroksidaza
o ceruloplazmin je protein, ki veže baker, poleg tega pa ima še oksidazno aktivnost
o α2-makroglobin ima biološko aktivnost proteinaznega inhibitorja, še posebej proti plazminu (fibrinolizin) in trombinu

• Proteini frakcije ß
o ß lipoprotein, ki predstavlja večji del te frakcije, je pomemben pri prenosu holesterola
o komponente komplementnega sistema
o hemopeksin veže prosti hem, ki se v krvi pojavi le, kadar se sprostijo abnormalno velike količine hemoglobina, npr. pri hemolitični anemiji
o Transferin služi prenosu železa



• Proteini frakcije γ
Sestavljajo jo predvsem imunoglobulini (Ig), ki se med seboj razlikujejo po molekulski velikosti in vsebnosti ogljikovih hidratov. Ločimo razrede: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.
IgG velja za prototip imunoglobulinskih molekul, zgrajen je iz dveh L-verig (variabilni, konstantni del) in dveh H-verig (3 konstantni, 1 variabilni del), ki sta med seboj povezani z disulfidnimi vezmi. Variabilni deli služijo za prepoznavanje antigenov. Antigen stimulira proliferacijo plazmatk, ki tvorijo protitelo, ki se veže na taisti antigen. Vsak klon plazmatk (klonalna teorija) lahko sintetizira le eno molekulsko vrsto Ig s strogo definirano AK sekvenco v variabilnem delu.

KVANTITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH BELJAKOVIN

Celokupna koncentracija plazemskih proteinov znaša 67-84 g/l (v serumu 63-80 g/l) in je lahko zvečana ali zmanjšana. Govorimo o hiper- in hipoproteinemiji, ki sta lahko relativni (gre za spremembo volumna plazme) ali absolutni (vezana je na spremembo količine proteinov).

• ABSOLUTNA HIPERPROTEINEMIJA je vedno posledica porasta koncentracij ene ali več patoloških komponent Ig sistema (najpogostejši vzrok je paraproteinemija).
• RELATIVNA HIPERPROTEINEMIJA nastane zaradi zmanjšanja volumna plazme. Kadar sta hkrati prisotna relativna hiperproteinemija in povišan hematokrit, govorimo o dehidraciji.

• ABSOLUTNA HIPOPROTEINEMIJA nastane zaradi povečane izgube beljakovin, največkrat albumina (pri opeklinah, nefrotskem sindromu); povečanega katabolizma (infekcije, poškodbe; gre za citokinski odziv na stres); zmanjšane sinteze (hepatitis, malnutricija, malabsorcija) .
• RELATIVNA HIPOPROTEINEMIJA nastane pri infuziji, popuščanju srca, anuriji, ker pride do zadrževanja vode in elektrolitov.

KVALITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH BELJAKOVIN
Sem spadajo paraproteinemije, disproteinemije in izpad posameznega proteina.


I. PARAPROTEINEMIJE

Paraproteini (M-komponente, monoklonski Ig, abnormalni Ig) so patološki imunoglobulini ali njihovi deli, katerih sinteza ni bila stimulirana z dotokom antigena. Njihova struktura ustreza popolnim Ig ali pa le posameznim peptidnim verigam (L-verige, redko H-verige). Nastanejo zaradi patološke pomnožitve enega klona plazmatk - zato monoklonska protitelesa. Ker gre za molekule iste velikosti in naboja, se pri elektroforezi gibljejo z isto hitrostjo in se zato ustavijo na istem mestu. To opazimo kot ozek zobec (t.i. M-monoklonski-vrh) na denzitogramu.

V okviru paraproteinemij poznamo benigne in maligne monoklonske gamopatije ter redke bolezni težkih verig.

MONOKLONSKA GLOBULINEMIJA NEDOLOČENEGA POMENA (BENIGNA MONOKLONSKA GAMOPATIJA)
Pri tej obliki najdemo v plazmi monoklonske imunoglobuline (MIg) vrste IgG, IgA, IgE in IgD. MIg so v tem primeru edini pokazatelj bolezni, ki se v 20 lahko razvije naprej v maligne monoklonske gamopatije (najpogosteje plazmocitom). Pogostost bolezni s starostjo narašča, značilna je predvsem za starejše ljudi. Za razliko od malignih bolezni (npr. multipli mielom) je paraproteinski nivo običajno nizek (<10g/L) in celo leto konstanten. Prisotnost lahkih verig v urinu (Bence-Jonesova proteinurija) je redka. Delež plazmatk v kostnem mozgu je manjši od 10, osteolize ne zasledimo.

MALIGNE MONOKLONSKE GAMOPATIJE
• MULTIPLI MIELOM (medularni plazmocitom) je tumor limfocitov B. Pomnožene, maligno spremenjene plazmatke v kostnem mozgu tvorijo paraproteine razredov G, A, D ali E in/ali L-verižne paraproteine. Ker se celice v kostnem mozgu razraščajo, s tem izrivajo hematopoetsko tkivo, zato pride do anemije. Tumorske celice sproščajo razne citokine, ki aktivirajo osteoklaste. Posledice osteolize so bolečine v kosteh, hiperkalcemija, patološki zlomi, pojavi se ledvična insuficienca in amiloidoza v ledvicah. V nasprotju z monoklonsko globulinemijo nedoločenega pomena, pa je v tem primeru Bence-Jonesova proteinurija pogosto prisotna. Pogoste so infekcije zaradi znižane koncentracije normalnih γ globulinov (pospešena razgradnja).
• PARAPROTEINEMIJA IgM (Waldenströmova makroglobulinemija) nastane, ko monoklonsko namnožene plazmatke tvorijo paraproteine razreda IgM. Izraz »makroglobulinemija« izvira iz sinonima za IgM, t.i. makroglobulina. Agresivnost do skeleta praviloma ni izražena (ni citokinske stimulacije osteoklastov, ni osteolize in hiperkalcimije), zaradi razraščanja celic v kostnem mozgu je možna anemija. Posledica same velikosti in polimerizacijske tendence IgM je sindrom hiperviskoznosti krvi (glej nadaljnje besedilo).

POSLEDICE PATOLOŠKIH PROTEINOV
Zaradi nizke koncentracije, neobičajne topnosti in lastnosti paraproteinov, včasih pa tudi znatno zmanjšane sinteze normalnih globulinov , se pri nekaterih bolnikih lahko pojavijo določeni patološki procesi.

• SINDROM HIPERVISKOZNOSTI je posledica zvišane koncentracije proteinov v serumu, zlasti makroglobulinov, zato je oviran tok krvi v možganih, prstih, ledvicah ali očeh (predvsem v retini). Očesno ozadje dobi karakterističen izgled: zelo razširjene venule in pogoste krvavitve. Bolniki postajajo zmedeni in v končni fazi lahko pride do težkih poškodb CŽS. Pešati začne tudi srce.

• KRIOGLOBULINEMIJA je posledica prisotnosti krioglobulinov v krvi. To so proteini, ki pod 37 kristalizirajo in tvorijo oborino, pri ponovnem segretju na 37 pa se popolno ali le delno stalijo. Njihova prisotnost lahko privede do motenj v pretoku krvi ter posledično nekrozo. Strukturno gre za komponente -globulinskega sistema, ki se delijo na enostavne (monoklonske) in mešane (poliklonske).
Monoklonske Ig (IgG, IgM) najpogosteje najdemo pri bolnikih z multiplim mielomom ali makroglobulunemijo. Mešano krioglobulinemijo običajno najdemo pri bolnikih z vnetnimi boleznimi vezivnega tkiva (avtoimune bolezni).

• BENCE-JONESOVA PROTEINURIJA
Bence-Jonesovi proteini so proste  in -lahke verige v obliki mono- ali dimerov. Monomerne oblike se filtrirajo (majhna M) skozi glomerule, se resorbirajo v proksimalnih tubulih, višek pa se izloči z urinom. Pri prehodu skozi distalne tubule in zbiralca se lahko stvorijo dimeri, ki se obarjajo, kar poškoduje transportne mehanizme in privede do sproščanja lizosomskih encimov. Zaradi nastale spremembe pH urina se prične obarjati še poseben mukoprotein, kar vodi do zamašitve tubulov in posledično odpovedi ledvic.
Bolezen se lahko dokaže s testom koagulacije: pri segrevanju kislega urina na 40 - 60 se proteini obarjajo, a ponovno raztapljajo pri 90; učinkovitejši metodi pa sta elektroforeza in imunoelektroforeza zgoščenega urina.

• AMILOIDOZA je izvencelično kopičenje proteinske oborine, ki je sestavljeno iz 2 osnovnih komponent: AA-komponente (amiloid A), značilne za sekundarno amiloidozo ter AL-komponente, ki se pojavi pri primarni amiloidozi in multiplem mielomu. Glede na vzrok in lokalizacijo vodi kopičenje amiloida k različnim sindromom.


II. DISPROTEINEMIJE
S tem izrazom označujemo stanje, pri katerem je razmerje med posameznimi frakcijami plazemskih proteinov porušeno, celokupna koncentracija pa največkrat ostaja v normalnih okvirih.

• AKUTNE BOLEZNI (miokardni infarkt, nekroza, akutne infekcije, tumorji, opekline, po operacijah)
Povečata se frakciji 1 in 2, zmanjša pa se albuminska frakcija.V okviru teh bolezni se sproži nespecifični odziv na stres. IL-1 in IL-6 spodbudita hepatocite k povečani sintezi beljakovin akutne faze (fibrinogen, haptoglobin, CRP, α1-antitripsin, komplement), katerih večina je v frakcijah α1 in α2, zmanjša pa se sinteza albumina.


• KRONIČNE BOLEZNI (pozne faze akutnega vnetja, maligni tumorji, alergijske in avtoimune bolezni, kronične infekciej in sistemske bolezni tkiv)
Spremembe v elektroferogramu: poleg beljakovin akutne faze (povečani frakciji 1 in 2) in zmanjšane frakcije albumina se pojavi tudi poliklonska hiperimunoglobulinemija (povečana frakcija  globulina). Le-ta je povezana s povečano sintezo različnih Ig kot odgovor na vdor antigenov (širok vrh na denzitogramu).



• SINDROM IZGUBE PLAZEMSKIH PROTEINOV
Proteini se lahko izgubljajo prek ledvic - nefrotični sindrom, pri katerem proteini prehajajo skozi glomerulni filter. Tako se dnevno lahko izgubi tudi do 50g proteinov, ki se tako pojavijo v urinu. Klirens narašča z zmanjševanjem molske mase. Tipična bolezenska slika pokaže izrazito zmanjšanje albumina (majhna M) in globulinske frakcije γ ter močan porast frakcij α2 in β (večja M), kar je posledica stimulacije sinteze vseh plazemskih beljakovin v jetrih zaradi znižanega onkotskega tlaka (globulini se zaradi velike M manj izgubljajo).
Pri enteralni izgubi proteinov (vnetni eksudati plazemskih proteinov v črevesju, motnje v odtočnem limfnem sistemu, limfne fistule, povišanje tlaka v venskem sistemu) ni nobene selekcije pri filtraciji odtekajočih proteinov, zato se zniža koncentracija vseh plazemskih proteinov (nivo α-globulinov se relativno poviša zaradi močnejše biosinteze).


• DISPROTEINEMIJA PRI KRONIČNIH JETRNIH BOLEZNIH
Pri kroničnih jetrnih boleznih (jetrna ciroza, kronični hepatitis) so običajno povišane koncentracije 3 glavnih komponent Ig-sistema (IgG, IgM, IgA) in znižane koncentracije albumina ter β-frakcije. Vzrok za povečano frakcijo  bi lahko bil vdor antigenov iz črevesa, saj zaradi portokavalnih anastomoz kri teče mimo jeter, ki tako izgubijo svojo nadzorno funkcijo. Hkrati pa se zaradi manjšega števila nepoškodovanih, funkcionalnih hepatocitov (ciroza) albuminska in frakcija  zmanjšata.

• A-γ-GLOBULINEMIJA
Ločimo dedno (X-vezano) in starostno (pridobljeno) obolenje.
Pri dedni obliki je pomanjkanje γ-globulinov skoraj popolno, odsotne so tudi plazmatke v bezgavkah, vranici in kostnem mozgu.



III. IZPAD POSAMEZNEGA PROTEINA

Gre za patološko stanje, pri katerem so posamezni proteini krvne plazme prisotni v spremenjeni obliki ali pa sploh niso prisotni (oz. v zelo zmanjšani količini). Največkrat je genetsko pogojena (gen je mutiran ali pa manjka). Izpad nekega proteina (specifična aproteinemija) ima lahko hude posledice ali pa sploh ni izražen.
Za diagnozo izpada se ponavadi uporablja imunofelektroforeza, ki omogoča ločevanje veliko večjega števila posameznih proteinov. Funkcionalno pomembne proteine plazme pa dokažemo na podlagi biološke aktivnosti. (če manjkajo, ustrezna aktivnost izostane (npr. faktorji strjevanja)).
Navajamo najbolj znana primera:


• ODSOTNOST 1-ANTITRIPSINA
Količina 1-antitripsina je nižja od normalne za približno 10. Količinsko predstavlja 1-antitripsin znaten delež 1-frakcije, zato lahko to anomalijo prepoznamo tudi s serumsko elektroforezo. Z imunofluorescenco je mogoče dokazati velike količine tega proteina v jetrnih celicah. Očitno je, da primarno ni motena biosinteza, temveč gre za mutacijo mehanizma izločanja iz celic. Kot posledica izginjanja antiproteaznega učinka je aktivnost proteaz v krvi (trombin, kininaze, komponente komplementnega sistema; proteaze levkocitov, granulocitov, makrofagov) in v tkivih povečana. Posebno v pljučih prihaja do razgradnje elastina, ki je ključnega pomena za normalno strukturo alveolnih sten; značilen je pojav juvenilnega (mladostnega) pljučnega emfizema.


• ODSOTNOST CERULOPLAZMINA (MORBUS WILSON)
Ta anomalija se deduje avtosomno recesivno. Tudi pri heterozigotih pride do izraza okvarjen gen, saj je vsebnost ceruloplazmina v serumu približno za 20 nižja kot normalno. Wilsonova bolezen spada k pogostim dednim anomalijam (1:500). Ceruloplazmin je najpomembnejši baker vezavni protein v plazmi. Njegova odsotnost ima za posledico hiter prehod bakra iz krvi v tkiva, kot tudi hitro izločanje preko ledvic. Enterična resorpcija bakra se poveča, nastane pozitivna bilanca bakra, kjub povečanemu izločanju z urinom. Najbrž ne gre za motnjo v proteinski sintezi; napaka zadeva pretvorbo neaktivne predstopnje v aktivni protein, ki veže baker. Prisotnost nakopičenega bakra spodbuja nastajanje hidroksilnega radikala (Fentonove reakcije), kar vodi do poškodb celic (membrane, proteini, DNA), najpogosteje so prizadeta jetra in CŽS.
SEDIMENTACIJSKA HITROST ERITROCITOV
Sedimentacijska hitrost eritrocitov (SHE) je preprost in poceni laboratorijski test, ki ga kliniki pri svojih odločitvah o zdravljenju uporabljajo že več kot 50 let. Vzorcu venske krvi najprej dodamo antikoagulant (npr. natrijev citrat), nato ga vsrkamo v 20 cm visoko stekleno cevko s premerom 2,5 mm. Pri testu izmerimo, za koliko mm se eritrociti v navpično postavljeni merilni cevki sesedejo v eni uri (razdalja od stebrička eritrocitov do vrha plazme).
Po Westergren-ovi metodi merjenja hitrosti sedimentacije (ki se uporablja v Sloveniji), so normalne vrednosti za mlajše moške do 10 mm, za ženske pa do 15 mm na uro. S starostjo te vrednosti naraščajo (npr. po pedesetem letu ta vrednost znaša za moške do 20 mm/uro, za ženske pa do 30 mm/uro). Zgornjo mejo lahko ocenimo tako, da za moške leta starosti delimo z 2, medtem ko za ženske letom starosti prištejemo 10 in nato delimo z 2.

MEHANIZMI SEDIMENTACIJE
Rdeče krvničke in vitro sedimentirajo, ker je njihova gostota večja od gostote plazme. Ker je plazma viskozna tekočina, usedanju eritocitov nasprotuje upor (zavirajoča sila), ki je odvisen od oblike eritocita, njegove hitrosti padanja in viskoznosti plazme (Stokesov zakon). V določeni točki padanja se sila upora izenači s silo teže eritrocita, hitrost postane konstantna, to je hitrost sedimentacije. Na faktor oblike vpliva stopnja agregacije eritrocitov. Pri zdravi osebi ne pride do agregacije, ker imajo eritrociti na površini negativni naboj, ki ga prispeva sialična kislina (disociirane karboksilne skupine), in se zato odbijajo. Naboj manjšajo beljakovine (najbolj fibrinogen, manj globulini in albumin), ki se vežejo na površino eritrocitov in tako omogočijo agregacijo eritrocitov v stebričke. Taka oblika je bolj hidrodinamična, zato je enak upor dosežen pri večji hitrosti (pospešena sedimentacija). To se zgodi pri spremembah sestave beljakovin plazme, ki so najpogosteje posledica citokinskega odziva na stres (beljakovine akutne faze).

SHE V KLINIČNI PRAKSI
SHE se v medicini uporablja kot diagnostični postopek, za spremljanje razvoja bolezni (npr. pri revmatoidnem artritisu) in učinkov terapije. V ta namen se danes pogosto uporablja kar določanje koncentracije CRP, ki je beljakovina akutne faze.

POSPEŠENA SEDIMENTACIJA ERITROCITOV:
Na pospešeno SHE vplivajo SPOL (ženske imajo normalno večjo SHE kot moški, razlike pa naj bi obstajale zaradi androgenov), STAROST (s starostjo se SHE veča), različna ZDRAVILA (na pospešeno SHE vplivata heparin in oralni kontraceptiki), in NOSEČNOST (SHE se poveča).
Spodaj so naštete bolezni, ki so najpogosteje povezane s pospešeno SHE.

• Infekcijske bolezni: SHE se poveča ob infekciji, posebno ob bakterijski (npr. pelvična vnetna bolezen,
meningealna toksemija, infekcijski miokraditis, tuberkuloza).
• Sistemske vnetne bolezni veziva, sklepov in žil: npr. revmatična vročica, revmatoidni artritis, polimialgija revmatika, temporalni arteritis. Običajno je SHE sorazmerna z aktivnostjo vnetja, zato nam je lahko v pomoč pri oceni zdravljenja.
• Malignomi: SHE je lahko povečana pri malignih spremembah, kot je npr. multipli mielom, Hodgkinova bolezen in bronhogeni karcinom, največkrat v napredovalem stadiju bolezni.
• Nekroze: SHE je pogosto pospešena po miokardnem infarktu.

3. BOLNIKI Z IZRAZITO POVEČANO SHE
Izrazito povečana SHE pomeni SHE nad 100mm/h in ima v tem primeru visoko napovedno vrednost (zelo zanesljivo kaže na bolezen). Hitrost, s katero tonejo rdeče krvničke v merilni cevki, je največkrat sorazmerna resnosti vnetja ali infekcije.
Po različnih svetovnih študijah velika večina bolnikov z izrazito povečano SHE oboleva za infekcijskimi boleznimi. Drugi najpogostejši vzrok za povečano hitrost sedimentacije so avtoimunske sistemske vnetne bolezni, na tretjem mestu so malignomi (pri veliki večini teh bolnikov so bile metastaze zelo lahko vidne). Pri manj kot 2 odstotkih ljudi s povečano hitrostjo ni bilo vidnega vzroka za povečanje SHE.









LITERATURA
1. Bedell SE, Bush BT: Erythrocyte sedimentation Rate, The american Journal of Medicine, Volume 78, Boston, Massachusetts, 1985, pp. 1001-1009
2. Gamulin S, Marušić M, Krvavica S (Eds): Patofiziologija, Jumena, Zagreb, 1988, pp. 773-776
3. W. Siegenthaler (Ed.): Klinische Pathophysiologie, Georg Thieme, Stuttgart, 1987, pp. 132-141
4. Karlson P, Gerok W, Gros W: Pathobiochemie, Georg Thieme, Stuttgart, 1982, pp. 360-372


PRIPRAVILI
Jana Kenda, Manca Kranjc, Veronika Potočnik, Špela Pretnar, Tinkara Srnovršnik, Blaž Šetina

MENTOR
prof. dr. Janez Sketelj, dr. med