UVOD

V nekaterih genetskih raziskavah ali forenzični medicini imamo ponavadi na razpolago zelo majhne količine DNA, npr. dedni material ene same celice, človeškega lasu, biopsiranega tkiva itd. Vzemimo, da se v raziskavi osredotočimo le na določeno (ni nujno poznano!) zaporedje v DNA. PCR reakcija je encimatska tehnika, ki omogoča pomnoževanje tega zaželenega specifičnega zaporedja DNA in vitro.S tem ga dejansko ojačamo in ga s tem lažje določimo ali kloniramo.


PRINCIP PCR REAKCIJE

Pri standardni PCR reakciji pripravimo vzorec DNA, ki ga raziskujemo, in koktejl reagentov:
 pufer
 deoksiribonukleotidne trifostafe (dNTP), in sicer 4 vrste: dGTP, dATP, dTTP,dCTP
 par oligonukleotidnih primerjev
 Taq DNA polimerazo

Primerja sta v bistvu zaporedji 20-30 baznih parov (Lairmore, 1990), od katerih vsak definira po en konec želenega opazovanega zaporedja/tarčne sekvence. Zaporedji nukleotidov v primerjih sta poznani, ne smeta pa biti komplementarni. Optimalna dolžina opazovanega zaporedja naj bi bila 100-1000 baznih parov (200-400; Lairmore, 1990).

Standardna PCR reakcija poteka v 3 stopnjah.


1. Temperatura je 92°C. DNA denaturira v dve ločeni vijačnici.

2. Temperaturo znižamo na 50-55°C. Primerja se pritrdita na komplementarno zaporedje, vsak na svojo verigo DNA, obrnjena drug proti drugemu s koncema 3`.

3. Temperatura = 72°C. Taq DNA polimeraza nato sintetizira komplementarno verigo DNA vsaki verigi v smeri 5` – 3`, torej le v eni smeri od primerjev. Reakcija poteka hitro, v minuti se sintetizira komplementarno zaporedje 1000 nukleotidov. [Taq DNA polimeraza je značilna DNA polimeraza termofilne bakterije Thermus aquaticus in je optimalno aktivna pri temperaturah 70-80°C.]






Slika 1 – Prikaz stopenj (glej tudi animacijo!)




V tej reakciji dobimo dve dvojni vijačnici DNA, obe vključujeta primerja. Ista reakcija se ponovi in že po dveh ponovitvah dobimo 2 dvojni vijačnici DNA (od osmih), ki sta dolgi toliko kot opazovano zaporedje plus na obeh konci daljši za začetnika. V vsaki ponovitvi je vedno več takšnih produktov. Ponavadi opravimo približno 30 ponovitev, dokler v koktejlu obstaja dovolj dNTP in začetnikov.

Označeno zaporedje DNA se je torej akumuliralo v epruveti. Sledi gelska elektroforeza.

Gelska elektroforeza je metoda, s katero specifično ločujemo makromolekule, npr.nukleinske kisline, proteine itd.na podlagi velikosti, naboja in drugih lastnosti (Bodlaj, 2001). Pri tem vzorec nanesemo na gel (uporabljamo agarozne ali poliakrilamidne gele). Gel igra vlogo »molekularnega sita«, skozi katerega se prebijajo makromolekule.
Z nanešenim vzorcem ga izpostavimo električnemu polju in določeni temperaturi. Nukleinske kisline iz našega zaporedja DNA zaradi različnega naboja, molekulske mase ter oblike potujejo po gelu z različno hitrostjo. Pot teh molekul je specifična. Naberejo se v določenih pasovih, en pas vključuje molekule iste vrste. Sledi označevanje nukleinskih kislin z etidijevim bromidom in fotografiranje.


Slika 2 – Slika po gelski elektroforezi


Razlaga slike:
Prikazuje 4 DNA produktov po gelski elektroforezi na različnih agaroznih gelih. Liniji spredaj in zadaj sta liniji markerjev, katerih molekulske mase so poznane. S temi markerji primerjajo produkte in jih prepoznajo. S puščico je prikazan neznani produkt. Obkroženi so primerji.




Značilnosti tehnike

Pozitivne strani:
Metoda PCR je zelo hitra, opravimo jo v manj kot enem dnevu posebnimi aparaturami »thermal cyclers«.
Metoda je lahko izvedljiva, saj je začetnike za potek metode enostavno in hitro sintetizirati. S PCR reakcijo lahko določimo specifični genski segment, torej je občutljiva in zaradi ponovitev zanesljiva.

Problemi:
Začetniki se lahko pritrdijo na napačne dele DNA. Naslednji problem izvira iz kontaminirane opreme. Če se v epruveti nahajajo določeni deli DNA iz prejšnjega poskusa, se to pomnoži z našo DNA in rezultati so izkrivljeni (problem! Pacienta, ki nima virusa HIV, lahko tako označimo za okuženega s tem virusom).





APLIKACIJE/UPORABNOST METODE PCR

PCR reakcija se uporablja tako v bazičnih kot aplikativnih znanostih. Za študij se s pomočjo PCR in izhajajoče metode RT-PCR (opisano v sledečem poglavju) konstruirajo cDNA knjižnice, mutacije določenih genskih zaporedij, analize interakcij protein – DNA, izraznost genov v tkivih, izraznost genov na določenih stopnjah, detekcija virusne DNA itd.

Metoda RT – PCR/aplikacije, izhajajoče metode

Iz celične RNA izoliramo mRNA, ki je krajša kot DNA v osnovni metodi PCR. Encim reverzna transkriptaza jo spremeni v enojno vijačnico DNA, poimenovano cDNA (komplementarna DNA veriga). Nato polimeraza I sintetizira še njej komplementarno verigo. Izhajajoče tehnike: RACE, Alternative splicing
Uporaba:
 konstruiramo cDNA knjižnice. V njih potem poiščemo zaželjene cDNA, izolirane kloniramo in uporabimo v raziskavah.
 analiza izraznosti genov med embrionalnim razvojem in razvojem zarodka, kjer je ponavadi na razpolago le časovno omejena količina RNA.

CDNA kloniranje

cDNA zaporedje, klonirano iz nekega organizma, lahko služi kot sonda za izolacijo komplementarnega zaporedja nekega organizma v knjižnici s cDNA. S tem lahko ugotovimo, ali je to zaporedje mogoče že poznano. Problem nastane, če ima cDNA iz knjižnice le določeno homologijo s to sondo, pride do mešanja in napačnih rezultatov.
Temu se izognemo na naslednji način:
Kloniramo kratko cDNA, ki določa človeški srčni Troponin 1 (TnIc), in jo z RT-PCR uporabimo za sondo, ki poskuša izolirati celotno cDNA iz knjižnice srčne cDNA.

Uporaba cDNA kloniranja:
 klonirati nova cDNA zaporedja s homologijo že poznanih zaporedij in genskih družin (npr.zaporedja družine genov SOX v zvezi z genom sry, ki določa spol sesalcev)
 kombinacija s pregledovanjem izraznosti genov v tkivih in na določeni razvojni stopnji celic
Ena izmed dodatnih tehnik cDNA kloniranja je »Southern blotting«.

RACE/Rapid amplification of cDNAs ends

Uporabimo le 1 primer. Izgrajevanje komplementarnih zaporedij poteka v katerikoli od smeri 5`-3` ali 3`-5`cDNA.
Uporaba:
 kloniranje zaporedij v smeri 5`, ki niso dovolj dobro predstavljene v knjižnicah cDNA
 kloniranje transkriptov, ki izvirajo iz alternative splicing (glej spodaj)
 določevanje novih postavitev genov (npr.določitev translokacije gena pri pacientu, ki trpi za vrsto akutne levkemije)

»Alternative splicing«

Začetnike, značilne za eksone nekega gena, uporabijo za analizo vrst mRNA, ki jih ta gen določa (npr.s tem so analizirali gen za distrofin).

GENETIKA&PCR

PCR namesto RFLP/Restriction fragment polymorphism/mapping

Namen je razkriti razlike pri ljudeh na nekem genskem lokusu študije dedovanja genov in dedovanja genskih nepravilnosti.
PCR je hitrejša metoda, zahteva manjše količine DNA kot RFLP, npr.en las, kanec človeške sperme, izolirani neoplojeni oocit itd. in omogoča, da določimo mnogo lokusov genov za neko bolezen. Študije vključujejo prenatalno diagnozo srpaste celične anemije, določitev Marfanovega sindroma, cistične fibroze, Duchennove mišične distrofije itd.

Mnogokratna PCR/Multiplex PCR

Uporabimo več primerjev, da pregledamo več mutacij na enem genskem lokusu, recimo pri Duchennovi mišični distrofiji.

DGGE/Denaturing gradient gel electrophoresis

Če ne moremo določiti spremembo le ene baze, uporabimo metodo DGGE. Osnovana je na dejstvu, da se »divji tip« in polimorfna DNA razlikujeta v nekaterih značilnostih taljenja med gelsko elektroforezo.

VNTRs/variable number of tandem repeats

Vključuje določanje kratkih ponovljenih zaporedij/minisatelitov. Uporablja jo forenzična medicina, da identificira posameznike iz zelo majhne količine DNA.
PCR omogoča bolj občutljivo preiskovanje minisatelitov, od katerih pa je večina nedostopnih (prevelikih itd.). Ta metoda je pripomogla k določitvi FRX sindroma (Fragile X syndrome).


PCR IN RAZISKAVE RAKA

RT-PCR omogoča identifikacijo zlitja verig mRNA, ki izvira iz prerazporeditev kromosomov v rakasti celici. PCR omogoča detekcijo točkastih mutacij s tumorskim supresor genom. Preučevan material je lahko svež, zamrznjen, fiksiran itd. Izhajajoči tehniki: ASO, SSCP

ASO/Allele specific oligonucleotide hybridization

Metoda odkrije točkovne mutacije na podlagi oligonukleotidov, ki nosijo le eno napačno bazo. Tak oligonukleotid hibridizira slabše z enakim kot tistim, ki nosi pravilni kod.


SSCP/Single stranded coformation polymorphism

Izboljšava metode DGGE. Uporabimo radioaktivno označene primerje ali dNTP. PCR produkte denaturiramo, ločimo z gelsko elektroforezo pri ne-denaturiranem poliakrilamidnem gelu. Produkt s spremenjeno bazo se drugače giblje po gelu.

Tkivna tipizacija/Tissue typing

Osnovan je na tissue typing HLA razred II lokusa na 6.kromosomu.
Uporaba:
 v forenzični medicini, določanje starševstva, bolezni, ki so v zvezi z razredom II (revmatoidni artritis), tkivna transplantacija

Detekcija virusov

Latentni virus, ki se nahaja v organih donorja, vodi k akutni infekciji po transplantaciji. Edina zanesljiva tehnika za določanje prisotnosti virusnega dednega materiala v tkivih za transplantacijo, tkivih s predpostavljenim virusom (HIV), protozoami, bakterijami itd. se uporablja PCR.



ZAKLJUČEK

Metodo PCR je leta 1983 iznašel Kary Mullis in zanjo prejel Nobelovo nagrado. Danes obstajajo izhajajoči protokoli, ki vsebujejo navodila za pridobivanje DNA iz različnih človeških tkiv in drugih virov. PCR pridobiva velikanski pomen v medicinskih genetskih raziskavah, vendar obstaja tudi vedno več konkurenčnih metod, npr.beta-Q-replikaza, transcription mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA) itd.

VIRI

Literatura
 Brand, N.J.(…). Principles and applications of the polymerase chain reaction. ….[osnovni članek]
 Bodlaj, J.(2001). Metoda PCR/Polymerase Chain Reaction. Seminar. MF, Ljubljana.
 Demšar, A.(2001). Polimerazna verižna reakcija. Seminar. MF, Ljubljana.
 Lairmore,T.C.(1990). Method. PolymeraseChainReaction. http://hdklab.wustl.edu/lab_manual/pcr/pcr1.html
 Lehninger…)
 Cooper…)

Spletni viri za nadaljne izobraževanje:
 Animacija principa PCR: http://dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html
 Problemsko zastavljena stran o PCR: http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html
 Protokoli za PCR: http://bric.postech.ac.kr/protocols/general_methology/general_protocol_25.html
 PCR v domači kuhinji: http://www.sciam.com/article.cfmarticleID=00035C6C-229B-1C74-9B81809EC588EF21&pageNumber=1&catID=2
 Biološki molekularni protokoli: http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/protocols.html
 Tabela standardnih genetskih zaporedij za 450 vrst: http://www.kazusa.or.jp/codon
 PCR slike za človeka: http://ra.microslu.washington.edu/protocol/documents/15K20human20PCR_WWWSiteFolder/image20index.htm
 Ponudnik Promega za reagente v PCR in »thermal cyclers«: http://www.kemomed.si/genomski.htm

Viri za slikovni material:
 Slika 1: : http://www.sciam.com/article.cfmarticleID=00035C6C-229B-1C74-9B81809EC588EF21&pageNumber=1&catID=2
 Slika 2: http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p00.html