Topologija nukelinskih kislin

Datoteke:
DatotekaVelikost
Snemi datoteko (struktura_nukleinskih_kislin.doc)struktura_nukleinskih_kislin.doc93 kB

Uvod

Vsi, ki nam je uspelo priti na ta faks smo se gotovo že srečali z nukleinskimi kislinami zato naj v uvodu zgolj na kratko ponovim, kar je tudi na predavanjih povedal profesor Zorko in naj bi večinoma že vedeli.

Molekula nukleinske kisline je polimerna molekula, sestavljena iz niza nukleotidov, ki so povezani s fosfodiestersko vezjo. Vsak nukleotid je sestavljen iz pentoze, fosforne kisline in dušikove baze. Dušikova baza je lahko purinska (adenin in gvanin) ali pirimidinska (citozin, timin in uracil). Polinukleotidni verigi sta povezani antiparalelno z vodikovimi vezmi in tvorita dvojno vijačnico. Večina DNA je v B-obliki, vendar obliko lahko prilagaja. Sposobnost DNA, da lahko spreminja obliko je odločilna za njeno delovanje. Da se lahko DNA podvoji ali izrazi, se morata verigi dvojne vijačnice začasno razpreti, pri tem pa se ne smejo prekiniti kovalentne vezi.

Znotraj celice so tudi druge oblike nukleinskih kislin (RNA), ki so enoverižne. Te lahko tvorijo dvojno vijačnico znotraj ene molekule na komplementarnih odsekih, ki se povežejo pa principu parjenja baz. Lahko se povežeta tudi dve samostojni molekuli, ki morata biti komplementarni. Povezujejo se lahko molekula DNA z drugo molekulo DNA, RNA molekula z RNA molekulo ali pa RNA z DNA molekulo.

Denaturacija in renaturacija

Iste značilnosti, ki dovolijo DNA izpolnjevanje svoje naloge, omogočajo delo z nukleinsko kislino in vitro in s tem izolacijo segmenta DNA, ki kodira specifičen protein.
Nekovalentne vezi, ki stabilizirajo molekulo, se prekinejo pri izpostavitvi visoki temperaturi ali pri visokemu pH (izpostavitev raztopini z nizko koncentracijo soli). Ko so prekinjene vse vodikove vezi, se verigi popolnoma ločita, kar se imenuje DENATURACIJA ali taljenje.

Denaturacija se zgodi v ozkem temperaturnem območju in se kaže v spremembi fizikalnih lastnosti. Molekuli DNA se zviša optična gostota. Heterociklični obroči posameznih nukeotidov imajo absorbcijski maksimum pri 260 nm. V verigi DNA je ta absorbcija 40 manjša. Ta pojav imenujemo HIPOKROMIČNI EFEKT.

Shema zmanjšanja absorbnosti:
Prosti nukleotid > enojna veriga DNA > dvojna vijačnica DNA

Denaturacijo se lahko tako spremlja z merjenjem spremembe v optični gostoti. Srednja točka temperaturnega intervala, v katerem se verigi ločita, se imenuje TALILNA TEMPERATURA (melting temperatura – Tm). Odvisna je od deleža G-C baznih parov. Med tema bazama so tri vodikove vezi in zato je ta par bolj stabilen, kot par A-T, ki ima dve vodikovi vezi. Več parov kot vsebuje DNA, večja je energija, potrebna za ločitev dveh verig. Če se delež G-C parov poveča za 1 naraste Tm za približno 0,4C.

(To je tudi razlog, da so območja, kjer se prične ločevanje verig DNA v dvojni vijačnici za podvojevanje bogata z pari A-T)
Stabilnost/višina Tm: DNA-DNA < DNA-RNA < RNA-RNA

Pri običajnih fizioloških pogojih leži talilna temperatura v območju med 85 in 95C. Primer: pri sesalcih, kjer je delež G-C parov 40, poteče denaturacija pri 87C, če pa je delež G-C parov 60 pa je Tm 95C. Dvojna vijačnica je torej v živi celici stabilna struktura.


Hibridizacija DNA po pravilu parjenja baz

Nukleinske kisline lahko obravnavamo na dva načina:

1) glede na PODOBNOST. Podana je z deležem baz (če gre za enojno verigo) ali baznih parov (če gre za dvojno vijačnico) ki so med seboj enaki. Podobnosti med dvema sekvencama ne moremo določiti, ne da bi predhodno določili celotno zaporedje baz teh dveh sekvenc)

2) glede na KOMPLEMENTARNOST. Ta je podana s pravili za parjenje baz in sicer A tvori vezi s T (dvojna vez) in G tvori vezi s C (trojna vez). V popolni dvojni vijačnici sta polinukleotidni verigi popolnoma komplementarni. Komplementarnost lahko merimo direktno s pomočjo sposobnosti enojnih vijačnic, da tvorijo bazne pare med seboj.

Pod določenimi pogoji je denaturacija reverzibilen proces. Sposobnost dveh komplementarnih vej, da se ponovno združita v dvojno vijačnico, se imenuje RENATURACIJA.
Renaturacija je odvisna od specifičnega parjenja baz med komplementarnima verigama. Reakcija poteka v eni ali dveh stopnjah. Če se med denaturacijo verigi nista povsem ločili poteče renaturacija v eni sami stopnji in sicer tako, da se ločena dela veri ponovno spojita. Če pa sta se verigi popolnoma ločili sta za renaturacijo potrebni dve stopnji. Najprej se dve verigi DNA po naključju srečata in če vsebujeta komplementarne odseke, se ta dva dela združita v kratek odsek dvojne vijačnice. Nato se po principu zapenjanja zadrge preostanek verig poveže v daljšo dvojno vijačnico. Z renaturacijo DNA ponovno pridobi lastnosti, ki jih je imela pred denaturacijo. Pojem renaturacije pa lahko razširimo tudi na reakcije med komplementarnimi enojnimi vijačnicami nukleinskih kislin, ki predhodno niso bile združene, da tvorijo novo dvojno vijačnico.

HIBRIDIZACIJA je torej reakcija, ko se združita dve nukleinski kislini različnih izvorov npr. en del je iz RNA, drugi pa iz DNA. Sposobnost hibridizacije lahko izkoristimo za preizkus komplementarnosti, saj se lahko združujejo le komplementarni deli verig. (Uporabljamo jo tudi za izolacijo in indentifikacijo specifičnih genov in RNA verig.)
Pri hibridizaciji zmešamo enojne vijačnice nukleinskih kislin in merimo količino materiala dvoverižnih molekul, ki je nastal. To reakcijo lahko dosežemo na dva načina:

 Hibridizacija v raztopini (solution (liquid) hybridization)
 Hibridizacija na filtru (filter hybridization)

Hibridizacija v raztopini
Raztopina vsebuje različne enojne vijačnice nukleinskih kislin, ki nato tvorijo dvojne vijačnice. Kadar imamo opravka z večjo količino snovi lahko reakcijo spremljamo tako, da merimo optično gostoto snovi. (Zmanjšanje absorbnosti med renaturacijo imenujemo HIPERKROMIČNI EFEKT).
Pri majhnih količinah snovi lahko ene od preparatov označimo z radioaktivnimi izotopi ter nato določimo količino dvojnih vijačnic, ki vsebujejo dani označevalec (kdor se je že učil za kolokvij iz biologije celice že ve, da se to metodo imenujemo IN SITU HIBRIDIZACIJA). Dobljene produkte se lahko analizira z uporabo kromatografije – ločimo enojne vijačnice od nastalih dvojnih. Lahko pa tudi odstranimo vse enojne vijačnice in merimo količino preostale snovi – dvojnih vijačnic.
Hibridizacija v raztopini ni primerna tehnika za raziskovanje podobnosti med pripravkoma, če en ali oba vsebujeta dvojne vijačnice DNA, saj če dvojne vijačnice denaturiramo, nato pa nastale enojne v obeh pripravkih pomešamo med seboj, se lahko del ene poveže z delom druge DNA, lahko pa se renaturirajo prvotne dvojne vijačnice. To nam otežuje oceno obsega hibridizacije.

Tej težavi se lahko izognemo s hibridizacijo na filtru. Zelo uporabni so filtri iz nitoceluloze, saj adsorbirajo enojne polinukleotidne verige DNA, ne pa RNA. Reakcija poteka tako, da eni od denaturiranih molekul DNA, ki je adsorbirana na filter dodamo drugo vrsto molekul DNA ali RNA. Ta se na filter adsorbira samo, če je zmožna tvoriti vezi z DNA, ki je že na filtru. Ponavadi se doda DNA ali RNA, označeno z radioaktivnim elementom, da se lahko meri stopnjo hibridizacije.
Ni nujno, da sta dve verigi popolnoma komplementarni, da lahko med njima pride do hibridizacije. Vseeno lahko tvorita nepopolno dvojno vijačnico, ki ni povezana na mestih, kjer so razlike.

Sekundarna struktura nukleinskih kislin

Stabilnost dvojne vijačnice je rezultat vodikovih vezi med bazami in interakcij med bazami, ki se skladajo vzdolž osi vijačnice. Te sile se lahko uporabljajo za določanje stabilnosti dvojne vijačnice med dvema komplementarnima sekvencama. Tehnika ugotavljanja stabilnosti je enaka pri DNA in pri RNA, čeprav je RNA običajno enojna veriga, ki znotraj ene verige tvori dvojno vijačnico.
Primarna struktura je pri DNA in pri RNA enaka in predstavlja zaporedje nukleotidov povezanih s 5 – 3 fosfodiesterskimi vezmi. Če so odseki na enojni verigi komplementarni, lahko ti deli tvorijo dvojno vijačnico znotraj ene polinukleotidne verige – sekundarna struktura. Enojna veriga se lahko upogne nazaj in tvori anptiparaleno strukturo, ki jo imenujemo lasnica (hair pin). Lasnica ima deblo (stem), na koncu pa del neparnih baz, imenovan zanka (loop). Bolj ko sta odseka s komplementarnimi bazami medsebojno oddaljena, večja je zanka. Sekundarne strukture oz. njihov obseg lahko merimo s pomočjo nekaterih NUCLEAS (encim ki degradira nukleinsko kislino), saj so enojne in dvojne verige različno dovzetne za te encime. Verjetnost za obstoj takšne sekundarne strukture je težko določiti, saj je na verigi več odsekov, ki bi bili zmožni tvoriti bazne pare s komplementarnimi regijami.
Verjetnost za obstoj takšne strukture se lahko predvidi s pravili, ki opisujejo interakcije med baznimi pari oz. stabilnost nastalih struktur. Pri tem se predpostavi, da je RNA izolirana struktura, zanemari se npr. vezavo s proteini. Osnova teh pravil je računanje proste entalpije (G) za nastanek strukture (G je termodinaski parameter, ki poda vrednost energije, ki je potrebna ali se sprosti ko poteče neka reakcija. Merimo jo v kcal/mol. Če se pri reakciji energija porablja je G pozitivna, če pa se energija sprošča je G negativna). Za nastanek baznih parov se mora energija sprostiti, kar pomeni, da je G negativna. Bolj kot je negativna (več energije kot se sprosti), bolj stabilna je nastala struktura. Celotna prosta entalpija je podana z enačbo:

G skupna = Gi + Gx + Gu (G = H - TS)

 Gi – prosta entalpija za začetek tvorbe dvojne vijačnice, ima pozitivno vrednost (+3,4 kcal/mol). Ta energija je potrebna za oblikovanje prvega baznega para. Nanaša se na intermolekularne oblike (med dvema verigama) in ne intramolekularne oblike (znotraj ene verige npr. lasnica).

 Gx – je vsota posameznih reakcij pri podaljševanju dvojne vijačnice ob dodajanju baznih parov. Ker se pri oblikovanju baznega para sprosti energija, je to negativna vrednost.

 Gu – je vsota energij potrebnih za odseke kjer baze niso komplementarne. Ta prosta entalpije je pozitivna.

Skupna prosta entalpija (G skupna) mora biti za tvorbo dvojne vijačnice negativna. Vrednost Gx mora preseči vsoto energij Gi (če je potrebna) in Gu.
Pri računanju moramo upoštevati interakcije, ki nastanejo znotraj posameznih parov baz in interakcije zaradi sosednjih baz v verigi:

a) oblikovanje vsake vodikove vezi sprosti nekaj energije in ker vsebujejo G-C pari po tri vodikove vezi, so bolj stabilni kot A-T/U pari, kjer sta dve vezi.
b) Med bazami, ki so zložene znotraj osi vijačnice v skladovnico, prihaja do hidrofobnih interakcij – znotraj vijačnice se ob zvitju dvojne vijačnice ustvari hidrofobno okolje.

Točna količina sproščene energije je odvisna od kombinacij posameznih parov. Dvojčki A-U parov imajo vrednost G med -09 in –11 kcal/mol. Dvojčki G-C in A-U para imajo G med –17 in 23, dvojčki samih G-C parov pa imajo G med –2 in –34 kcal/mol.
V molekuli RNA se lahko tvori še nepravilni par G-U (v dvojnih vijačnicah DNA je to par G-T, iz običajne dvojne DNA je izključen). G zanj znaša med –05 in –15 kcal/mol – odvisno od sosednjega baznega para. Energija, sproščena pri nastanku dvojnega dela vijačnice se dobi s seštevanjem prostih entalpij, za vsak dvojček sosednjih parov. Vsak par prispeva k prosti entalpiji za dva dvojčka – na vsaki strani, razen baznega para na koncu vijačnice. Za razliko od dvojne vijačnice DNA se v dvojni vijačni strukturi RNA ponavadi tvorijo enovijačni predeli zaradi nekomplementarnosti baz na teh mestih. Lahko so različnih oblik:

a) Lasnične zanke (hair pin loops) nastanejo na koncu dvojne vijačnice, kjer se veriga upogne nazaj in tvori pare z bližnjim komplementarnim zaporedjem.
b) Notranje zanke (interior loops) pa nastanejo na nekolemtarnih delih vijačnice.
c) Izbokline (Bulges) nastanejo v komplementarnih zaporedjih, kadar eno izmed zaporedij vsebuje dodatno bazo, ki ne tvori para.

Vsi ti neparni deli ovirajo nastanek dvojne vijačnice, njihov prispevek k prosti entalpiji je pozitiven, vključen je v parameter Gu. Da se lahko ohrani dvojnovijačna struktura je potreben dodaten vložek energije, nastale s parjenjem baz. Za notranje zanke in izbokline količina energije narašča z velikostjo takšne zanke, med tem ko lasnične zanke zahtevajo več energije že pri manjših dimenzijah.
Stabilnost potenicialne dvojne vijačnice je določena s skupno prosto entalpijo, ki mora imeti za tvorbo sekundarne strukture zadosti negativno vrednost.

Invertne/obrnjene ponovitve in sekundarna struktura

Kadar ima enojna vijačnica dve komplementarni zaporedji, lahko ti dve zaporedji tvorita dvojno vijačnico znotraj enojne (npr. lasnico), saj sta smokomplementarni. Zaporedje znotraj dvojne vijačnice, ki ustreza takšni strukturi, sestoji iz dveh kopij identičnih zaporedij, predstavljenih v obratni orientaciji in se imenujeta invertni ponovitvi. Zaporedje obeh invertnih ponovitev skupaj se imenuje palindrom in je definirano kot zaporedje dvojne vijačnice DNA, ki je enako če beremo iz ene ali pa iz druge smeri:

5 TTAGCACGTGCTAA 3
3 AATCGTGCACGATT 5

Zaporedje je palidromično, saj če beremo zgoraj od 5 proti 3, dobimo isto zaporedje, kot če beremo od spodaj od 3 proti 5.

*zrcalna ponovitev 5 TTAGCAC CACGATT 3
3 AATCGTG GTGCTAA 5

Invertna ponovitev se lahko izrazi tudi v sekundarni strukturi enojne ali pa dvojne vijačnice nukleinske kisline. V daljšem palidromu enojne vijačnice lahko pride do nastanka baznih parov, kar privede do nastanka sekundarne strukture.

V dvojni vijačnici lahko pride do parjenja baz samo, če se vijačnici med seboj ločita. Znotraj vsake nastale enojne verige lahko nato pride do nastanka baznih parov. Tako nastala formacija se imenuje križ (cruciform), nastala je iz stika štirih komplementarnih regij. To je oblika, ko nastaneta lasnici druga nasproti druge, vsaka na svoji verigi. Prvotna dvojna vijačnica se razteza na obe strani, znotrajvijačni verigi pa molita navzven. Nastanek križa in vivo je skoraj nemogoč, saj je za ločitev verig dvojne vijačnice potrebna precejšnja energija (G približno 50 kcal/mol) in nastanek nove, križaste oblike ne bi v celoti nadomestil energije, potrebne za nastanek stabilne strukture, saj je njena struktura energijsko manj stabilna od strukture dvojne vijačnice (za G približno 18 kcal/mol). Kljub temu pa se križasta struktura lahko tvori v primernih pogojih in vitro.
križaste strukture SO in vivo sicer našli v bakteriji E.Coli, predvideva pa se, da nastanek take strukture v evkariontskih celicah ni možen (ali pogost), ker bi bila struktura preveč nestabilna za obstoj.

Različni tipi dvojnih vijačnic

Dvojne vijačnice lahko glede na njihovo značilno obliko razvrstimo v več družin. Desnosučne strukture, kot so npr. A-, B- in C- tip vijačnice poznamo že dalj časa, medtem ko je bila levosučna Z- oblika, ki se od prej omenjenih precej razlikuje, odkrita šele pred kratkim.
Za opis posameznega tipa uporabljamo naslednja parametra:

a) n, ki nam pove število nukleotidov na en zavoj
b) h, ki predstavlja razdaljo med sosednjima nukleotidoma.

Parametri lahko znotraj ene družine variirajo, npr. vrednost n za B-DNA je lahko 100 – 106. Med desnosučnimi oblikami lahko pride do prehodov, nanje vplivajo spremembe pogojev v okolici.

Osnovna oblika DNA v celici je B-vijačnica. B oblika ima malo in veliko brazdo. Velika brazda je točka, na katero se vežejo proteini. Razlike med bazami so najlažje razpoznavne v veliki brazdi, ki je večja stična točka za proteine, ki vežejo specifične sekvence DNA. Klasični model B-vijačnice predvideva, da je št. nukleotidov v dvojni vijačnici, ko se le-ta zasuče za 360, 10, vendar so meritve števila baznih parov na obrat pokazale, da je vrednost nekoliko večja in sicer 10,4 baznih parov.

A-vijačnica je verjetno najbolj podobna področjem dvojne RNA verige, kjer prisotnost 2 hidroksilne skupine onemogoča nastanek B-vijačnice. Tudi hibrid med DNA in RNA je verjetno A-vijačnica. Razlika med A in B- vijačnico je v tem, da so baze v A-vijačnici nekoliko nagnjene glede na os vijačnice, medtem ko v B-vijačnici ležijo v ravnini, pravokotni na to os. Velika brazda leži pri A-vijačnici globje in jo pokrivajo fosfatne skupine, manjša pa je bolj na površju. Še vedno niso povsem prepričani, ali se A-oblika dvojne vijačnice nukleinskih kislin pojavlja tudi in vivo.

Z-vijačnica se od ostalih skupin vijačnic razlikuje v tem, da je edina levosučna vijačnica, ima največ baznih parov na obrat in je zato od vseh najmanj zavita. Je tanjša vijačnica, ima samo eno brazdo, ime pa je dobila po cik-cak (Zig-Zag) obliki, ki jo tvorijo fosfatne skupine. Pojavi se v polimerih, za katere je značilno zaporedje izmenjujočih se purinskih in pirimidinskih baz. Z-vijačnico so otrikili in vitro pri zelo nenavadnih pogojih (visoka koncentracija soli) ko so proučevali obnašanje baznih parov pod temi pogoji. Z-DNA naj bi zasledili v pro in evkariontckih celicah, njena funkcija pa še ni poznana.

Skeletna DNA je velezvita

Dvojno vijačnico DNA predstavljamo kot linearno molekulo, v celici pa DNA večinoma nima prostih koncev, ampak je sklenjena. Genomi nekaterih majhnih virusov imajo krožno DNA, v genomih bakterijskih in evkariontskih celic pa DNA vijačnica tvori velike zanke. O VELEZAVITI (supercoiled) DNA govorimo, kadar je dvojna vijačnica zvita v prostoru tako, da križa samo sebe in s tem tvori tesno zvito strukturo. Molekulo, ki ni dodatno zvita v prostoru, imenujemo sproščena molekula.

Do velezvitja prihaja pri vseh celičnih DNA in je natančno regulirano. Super oz velezvitje je pojav, ki nastopi kot posledica neke sile oz napetosti na sklenjeno/krožno molekulo. Ko pri sklenjeni molekuli pride do odstopanja od navadne B-oblike vijačnice (trakova se lahko delno odvijeta ali bolj tesno zvijeta  spremeni se št. baznih parov na obrat vijačnice) to postavi molekulo v termodinamično neravnovesje oz napetost, ki jo DNA sprosti s pomočjo velezvitja. Če se zvitje same vijačnice zmanjša, oz. če se zmanjša kot med baznimi pari, pravimo da je molekula podzvita. Taka molekula se zvije v obratni smeri kot sta zviti verigi dvojne vijačnice sami med seboj, govorimo o negativnem velezvitju. Zaradi takšnega zvitja se verigi se lahko tudi delno ločita, vendar je to termodinamsko manj ugodno, saj prekinitev vodikovih vezi, ki stabilizirajo dvojno vijačnico zahteva več energije kot velezvitje molekule.

Delna ločitev oz razvitje trakov pri podzvitju zagotavlja zadostno ločitev obeh verig, ki je potrebna za nastanek križa (cruciform), torej posredno potencialno omogoči nastanek te strukture.

Pozitivno velezvitje pa še bolj trdno zvije molekulo DNA. Takšno stanje dobimo in vitro.

Velezvitje DNA pogosto opisujemo z velezvitno gostoto (superhelical density). Ta nam pove število »velezavojev« na obrat dvojne vijačnice. V originalu je bila superhelical density opisana kot parameter:
 =  / 
 predstavlja št »velezavojev« ,  pa predstavlja število zavojev vijačnice (približno število baznih parov deljeno z 10).  torej odgovarja številu »velezavojev« na 10 baznih parov. Za podzvite oz negativno zvite vijačnice je  negativen, za nadzvite oz pozitivno zvite vijačnice pa je pozitiven.

Drug način opredelitve velezvitja pa je z navojnim številom L (linking number). Pove nam število obratov, ki jih ena veriga dvojne vijačnice naredi okoli druge. Veriga mora biti sklenjena, drugače L ni defineran. L je vedno celo število (je topološki parameter molekule). Ima dve komponenti – W in T (sta geometrična parametra, zato ni nujno, da sta celi števili):

L = W + T

T ali vijalno število (twisting number) je povezano z zvijanjem vijačnice na eni sami osi. Pomeni število baznih parov na en obrat dvojne vijačnice.
W (writhing number) predstavlja število zavojev, ki jih dvojna vijačnica naredi v prostoru. Za sproščeno molekulo velja W=0.
Za sklenjeno verigo DNA je L število vedno enako, saj se zaradi dodatnega zavijanja v prostoru spreminja tudi periodika obratov v dvojni vijačnici, ne glede na to ali je dodatno zvita v prostoru ali ne.
Navojno število L se lahko torej poveča (+L, za zmanjšanje podzvitja) ali zmanjša (-L, za povečanje negativnega velezvitja in/ali podzvitja).

L+/-1 lahko dobimo tudi tako, da eno od verig prekinemo, zarotiramo okoli sklenjene za 360 in jo nato ponovno sklenemo. To ne vpliva na št baznih parov ali št atomov v krožni DNA. Razlika je le v topoloških lastnostih, zato tako molekulo imenujemo TOPOIZOMER.
Razvidno je torej, da velezvitje ni naključen proces ampak je največkrat posledica sile trenja, ki se pojavi pri povečanju ali pomanjšanju L molekule DNA glede na klasično B-obliko.

Spremembo navojnega števila katerega koli stanja DNA lahko opišemo z specifično navojno razliko

 = L / L

L predstavlja navojno število, ko je molekula DNA sproščena. V primeru, da bi bila celotna sprememba navojnega števila posledice spremembe W (T=0), je specifična navojna razlika enaka superhelical density (to velja vse dokler ostaja struktura dvojne vijačnice nespremenjena).

Če se verigi ne ločita se L ne spreminja, spreminja se zgolj razmerje med T in W. Kot smo že omenili, celica zelo natančno regulira proces velizvitja in sicer s pomočjo encimov, ki jih imenujemo TOPOISOMERAZE. Njihova edina funkcija je da molekulo »pozvijejo« ali pa sprostijo  torej da spremenijo njeno L. Delimo jih na 2 tipa (tip I in II), ki se razlikujeta v mehanizmu delovanja. Te encimi delujejo tako v pro, kot tudi v evkariontckih celicah. Navojno število L se zaradi delovanja topoizomeraz spremeni za celo število, ta vrednost pa je karakteristična za določeno reakcijo. S pomočjo te posebnosti lahko ugotovimo do kakšnih sprememb v zvitju bo prišlo pri delovanju določenega encima.

Za dodatno zvijanje molekule je potrebna energija. Čim bolj je molekula dodatno zvita, več energije hrani (negativno velezvitje predstavlja torej skladišče energije!).

Vsi genomi, ki so jih proučevali vsebujejo negativno velezvitje. Tipična stopnja le.tega in vivo je 1 negativni velezavoj na 200 bp (=-005), to pa hrani povprečno –9 kcal/mol energije na molekulo.

Povečano dodatno zvijanje v nekaterih odsekih molekule (stopnja velezvitja po molekuli se ralikuje, ni konstantna.) je lahko povezano s strukturnimi prehodi DNA in sicer se dodatna energija, ki jo vsebuje dodatno negativno zvita molekula, lahko porabi za ločevanje obeh verig DNA. Stopnja energije potrebne za ločitev verig je odvisna od baznih parov. Ima nasprotno vrednost kot energija, ki se sprosti pri tvorbi le-teh baznih parov ob nastajanju dvojne vijačnice (povprečno 12-50 kcal/mol za ločitev 10bp). Čeprav en zavoj v dodatno zaviti DNA ustreza energiji, ki omogoča ločitev le majhnega števila baznih parov, je taka energija pomembna predvsem na začetku ločevanja DNA v procesu identičnega podvajanja.

Dodatno zvijanje je regulirano z ravnotežjem nad aktivnostjo encimov, ki povzročajo dodatno zvijanje DNA in aktivnostjo encimov, ki ta proces preprečujejo. Nekatera zaporedja DNA se ukrivijo sama po sebi (zaradi interakcij med bližnjimi bazami v vijačnici), v drugih primerih dodatni zavoji nastanejo zaradi proteinov, ki povezujejo posamezne dele DNA in jo tako deformirajo.

Povzetek

Sposobnost DNA enojnih vijačnic, ki tvorijo dvojno vijačnico, da se ločijo, lahko in vitro posnemamo z denaturacijo. Talilna temperatura Tm je ena od mer za stabilnost dvojne vijačnice. Komplementarni nukleinski kislini lahko renaturirata ali hibridizirata (kadar prihajata iz različnih dvojnih vijačnic).
Za tvorjenje dvojne vijačnice med dvema komplementarnima sekvencama, morajo reakcije parjenja baz oddati dovolj proste entalpije (G) za pričetek parjenja in za premaganje ovir, ki jih predstavljajo nekomplementarni pari baz v dvojni regiji. Prosta entalpija sproščena ob parjenju baz je odvisna od sekvence parov. Invertne (oz. obrnjene) ponovitve lahko načeloma tvorijo križ z intramolekularnim parjenjem namesto z intermolekularnim parjenjem. Vendar taka formacija zahteva velik del energije in je zato malo verjetno, da bi se pojavila in vivo.
Vsaka družina dvojnih vijačnic nukleinskih kislin dopušča lokalne variacije v številu baznih parov na zavoj in rotacije na bazni par. A, B in C strukture so desnosučne. DNA se v fizioloških pogojih načeloma pojavlja v B-obliki; RNA in DNA-RNA hibridi pa se navadno pojavljajo v A-obliki. Z-DNA je levosučna konformacija in se tvori in vitro z določenimi preprostimi ponavljajočimi se sekvenvcami, kot so ponovljene pirimidinske in purinske baze.
Do velezvitja oz Supercoiling pride, ko se dvojna vijačnica DNA sama zvije v prostoru. Opišemo ga lahko z staro terminologijo kot gostoto velezvitja (supercoiling density) ali novejšo terminologijo z navojnim številom (linking number). Negativno velezvitje zasuče DNA okrog lastne osi v obratni smeri kot je zavita desnosučna dvojna vijačnica (le-ta je zvita v smeri urinega kazalca). Sila trenja se zmanjša z zmanjšanjem rotacije na bazni par v dvojni vijačnici ali dokončno z odvitjem dvojne vijačnice v ločeni enojni vijačnici. Tipična vrednost za negativno velezvitje in vivo je –1obratov/200bp oz velezvitna gostota –0,05. Velezitje je lahko lokalno zelo pomembno pri odvijanju dvojne vijačnice DNA in na splošno pri reakcijah, ki zahtevajo razvitje oz ločitev dvojne vijačnice.
V nasprotju z mnenjem, da je DNA zgolj monotona, linearna dvojna vijačnica, je DNA v celici stisnjena v jedru s pomočjo deformacij strukture, ki vključujejo velezvitje in upogibanje. To se lahko odraža v opaznejših odstopanjih od povprečnih parametrov B-oblike DNA.

VPRAŠANJA

ALI JE MOŽNA HIBRIDIZACIJA MED NUKLEINSKIMI KISLINAMI RAZLIČNIH VRST NPR. MED ČLOVEŠKO IN ŽIVALSKO

Hibridizacija je definirana kot reakcija ob združitvi dveh komplementarnih nukleinskih kislin različnega izvora v dvojno vijačnico. S tem se ne omejimo le na različne ljudi. Prav tako je možna hibridizacija med katero koli živalsko vrsto DNA. Edina omejitev za potek hibridizacije je kompatibilnost obeh verig. Posledica evolucije je, da imajo mnogi različni organizmi nekatere proteine in RNA-je s podobno funkcijo in podobno zgradbo. Iz tega lahko sklepamo, da imajo potencialno tudi podobne sekvence nukleinskih kislin. Bližje kot sta si vrsti organizmov (glede na evolucijski razvoj) večjo bo stopnja hibridizacije med njunimi nukleinskimi kislinami.

KAJ JE PRAVZAPRAV TOPOLOGIJA

V Leningerju so jo definirali kot matematično stroko, ki proučuje lastnosti objekta, ki se ne spremenijo kljub kontinuiranim obremenitvam.

V ČEM SE RAZLIKUJETA OZ KAKŠNA STA MEHANIZMA DELOVANJA TOPOIZOMERAZ

Topoizomeraze tipa I delujejo tako, da eno od obeh sklenjeni verig dvojne vijačnice razprejo, nato pa enega od pretrganih delov zarotirajo okoli sklenjene verige ter nazadnje ločena konca ponovno spojijo. S tem torej povečajo navojno št L za 1.
*Pri E.Coli poznamo dve vrsti teh encimov, topoisomerasa I in III. Ta dva encima ponavadi sproščata molekule DNA z odstranitvijo negativnega zvitja, torej z povečanjem L.
** Pri evkariontskih celicah velja enako kot za ta E.Coli

Topoizomeraze tipa II pretrgajo obe verigi dvojne vijačnice in s tem spremenijo navojno število L za 2.
*Pri E.Coli te encime predstavljajo topoisomerase II ali DNA gyrase, ki povečajo negativno velezvitje ter s tem zmanjšajo L.
**Pri evkariontskih celicah imamo 2 vrsti teh encimov; topoisomerse II in II, ki pa ne moreta povzročiti negativnega velezvitja (podzvitja), lahko pa sprostita molekulo negativnih ali pozitivnih dodatnih zavojev.

ALI LAHKO VELEZVITJE ZAVZAME RAZLIČNE OBLIKE (različni zavoji, ne samo glede na smer)

Lahko vam omenim dve vrsti negativnega dodatnega zvitja, ki ju lahko zavzame isti segment podzvite DNA (iz tega je razvidno, da podzvitje prispeva k skrčitvi DNA na zadostno »majhnost«):

PLECTONEMIC (iz grščine Plectos-zvit, nema-vlakno, nit) vse strukture, ki so dodatno zvita na enostaven način, to je tudi najpogostejša oblika, ki jo DNA zavzame, ko se nahaja v raztopini. Je desnosučna, ter ponavadi dolga in ozka s številnimi vejami/odrastki. (dejanska dolžina DN se zmanjša na 40)

SOLENOIDAL oblika dodatnega zvitja pa zagotavlja kompaktnost, ki jo molekula DNA potrebuje da se lahko spravi v jedro. Pojavi se na podzvitih molekulah. Sestavljena je iz ozkih levosučnih zavojev (spominja na zloženo vrtno cev ali telefonski kabel). V raztopini je ta oblika manj stabilna od prejšnje, vendar se lahko stabilizira z vezavo proteinov. Najdemo jo v kromatinu.

You have no rights to post comments