Nekaj osnov o molekuli RNA
RNA je zgrajena iz ribonukleotidov, ki so med seboj povezani s fosfodiestrskimi vezmi. Ti vsebujejo ribozo, ostanek fosforne kisline in organsko bazo. Te so enake kot pri DNA, z izjemo uracila, ki nadomešča timin. Čeprav je RNA enojna vijačnica, lahko na določenih odsekih tvori dvojno vijačnico. Komplementarne bazne pare tvorijo adenozin (A) in uracil (U) ter citozin (C) in gvanozin (G). Možno je tudi spajanje G in U, vendar je interakcija šibkejše narave. DNA se v procesu transkripcije prepiše v RNA (1 veriga v smeri 5 → 3). Ta veriga zavzame obliko desnosučne vijačnice, njeno obliko pa vzdržujejo hidrofobne interakcije in H-vezi.
Poznamo več vrst RNA molekul: Ribosomalno RNA (rRNA), obveščevalno RNA ( mRNA) in prenašalno RNA (tRNA).

Nukleinske kisline in proteini
RNA in DNA nosita številne informacije o metabolizmu in reprodukciji celice, proteini pa so funkcionalne molekule, ki lahko katalizirajo ogromno metabolnih reakcij. Do nedavnega je veljalo, da se ti kategoriji ne prekrivata, torej, da si molekule informacijske in katalitične naloge delijo. Leta 1981 pa so prvič zasledili molekulo RNA, ki ima tudi vlogo encima. To odkritje je postavilo nekaj novih temeljev v biokemiji:
- Proteini niso več odgovorni za vsako katalizno reakcijo v celici.
- Zelo verjetno je, da je sinteza proteinov odvisna od katalitičnih lastnosti RNA. (ribosome poleg proteinov sestavljajo tudi številne molekule RNA, ki imajo morda ključno vlogo pri katalizi.)
- Evolucijsko je mogoče, da se je RNA razvila ločeno od proteinov in DNA in takrat delovala kot nosilka informacij in kot encim.

RNA kataliza
Prvi primer katalitske aktivnosti RNA so odkrili leta 1981/82, ko so Thomas R. Cech in njegovi sodelavci proučevali RNA praživali Tetrahymena thermophila. Odkrili so, da tovrstna RNA lahko katalizira rezanje in zlepljanje, kar ji omogoča odstranitev dela lastne strukture. Tako se je RNA približala definiciji encima. Obstajala pa je ena razlika, ki je RNA ločila od encimov. Encimi delujejo raje na druge molekule kot sami nase. Zato so si za tovrstno RNA izmislili nov termin, ribocim. Pred kratkim pa so odkrili, da malce drugačna oblika enake RNA deluje tudi na druge molekule, zato jo lahko uvrščamo tudi med encime v pravem pomenu besede.

Potreba po katalizatorjih
Katalizatorji so potrebni zaradi narave bioloških molekul. Molekule, ki sodelujejo v encimskih procesih so večinoma izredno stabilne in zelo počasi reagirajo z drugimi molekulami. Encimi pa te reakcije pospešijo (več milijonkrat). Iz reakcije encimi izstopajo nespremenjeni. Logično se je zdelo, da so vsi encimi proteini, saj so v desetletjih po odkritju prvega encima ureaze odkrili na stotine encimov, za katere se je izkazalo, da so sestavljeni iz verige aminokislin, ki so zvite v značilno in zelo specifično tridimenzionalno strukturo, ki encimu omogoči, da katalizira le eno ali eno skupino zelo sorodnih biokemijskih reakcij. Prav tako kot encimi morajo tudi ribocimi zavzeti značilno terciarno strukturo, ki mora hkrati biti ravno prav stabilna, saj se mora hitro prilagajati spremembam v katalitičnem ciklusu.

RNA izrezovanje
Leta 1977 so znanstveniki ugotovili, da genski zapis ne poteka nepretrgano, ampak je gen razcepljen. Odseke nukleinskih kislin, ki nosijo zapis za aminokisline v polipeptidu (eksone) prekinjajo dolgi nekodirajoči odseki (introni), ki se po prepisu iz DNA izrežejo iz RNA v procesu, ki ga imenujemo tudi dozorevanje RNA. Gre za t.i. princip cepljenja (cleavage) in spajanja (splicing). Pojav je značilen samo za evkarionte; daje pa jim precejšen evolucijski potencial tudi za razvoj specializiranih tkiv.
Ker ima RNA izrezovanje velik vpliv na regulacijo genskega izražanja, so ga začeli preučevati v številnih laboratorijih. Osredotočili so se na rRNA gene evkarionta Tetrahymena thermophila. Poskušali so določiti mehanizem cepljenja in spajanja, ki oblikuje končno, funkcionalno molekulo rRNA. Ugotovili so, da za to niso potrebni encimi, potreben pa je določen tip gvanina (GTP) in Mg ioni.
Tetrahymena thermophila vsebuje 4 rRNA, od katerih so 3 prepisane kot samostojne enote RNA. Primarni zapis se izreže, ponovno zlepi in oblikuje svojo končno obliko. V nekaj sekundah po transkripciji se iz primarnega zapisa (6400 nukleotidov) izreže 414 nukleotidov dolg intron, sosednja eksona pa se zlepita. Opazili so tudi, da je izrezovanje zelo učinkovito v testnih sistemih, ki vsebujejo mešanice izoliranih jeder Tetrahymene. To jih je spodbudilo, da so začeli natančneje preučevati te mehanizme.

Ribocim
Najprej je bilo potrebno določiti minimalne pogoje za izrezovanje introna. Primarno rRNA iz Tetrahymene so zmešali z izvlečki jedra istega organizma in dodali še nekaj molekul kot so soli, voda in nukleotidi, ki služijo kot vir energije. Izkazalo se je, da so ključnega pomena Mg ioni in gvanozin fosfat v poljubni obliki (GMP, GDP, GTP), jedrni ekstrakt pa ni bil potreben. Prvič so podvomili v dogmo, da so vsi encimi proteini, vendar pa je še niso mogli zavreči.
Ponudi sta se jim dve možnosti: 1. Encimska aktivnost prihaja iz proteina, tako tesno povezanega z RNA, da ga niso uspeli izločiti.
2. RNA sama katalizira svoje izrezovanje.
Dvome so pregnali s poskusom sinteze pre-RNA prepisane iz rekombinantne DNA. Ta je zrasla v bakteriji Escherichia coli, bila nato odstranjena, prečiščena in prepisana v RNA z encimi E. coli, ki so jih takoj odstranili. Ker ni bila dobljena RNA nikoli v stiku s celico, so lahko izključili možnost, da je vsebovala proteine za izrezovanje. Kljub temu pa se je še vedno izrezala in to na istih mestih kot v prejšnjih poskusih. Tako ni bilo več nobenih dvomov: RNA intron Tetrahymene thermophile se izreže sam, brez pomoči encimskih proteinov.
Avtoizrezovanje pa je bilo v več pogledih podobno delovanju encimov. Reakcije so bile visoko specifične in pospešene za več redov. Poleg tega je RNA, ki ni bila pravilno zvita, izgubila sposobnost izrezovanja. Za razliko od encimov pa je RNA delovala sama nase, zato so tovrstno RNA poimenovali ribocim.

Kako ribocim deluje
Kot pri proteinskem encimu je tudi pri ribocimu ključnega pomena pravilna 3-D struktura (krožna oblika). Ribocim katalizira reakcijo z vezavo 2 substratov (gvanozina in 6 pirimidinov) v veliki bližini in pravi orientaciji. Intron preko ciklizacije ustvari vezavna mesta za gvanozin in pirimidine ter aktivira fosfatno skupino na vsaki strani. Taka oblika je primerna za razcep, ni pa še točno znano na kakšen način zvitje aktivira fosfatne skupine na mestih izrezovanja. Intron se lahko cepi tudi brez prisotnosti gvanozina, vendar je reakcija neprimerno počasnejša. V odsotnosti gvanozina služijo kot napadalne skupine hidroksilni ioni v raztopini. Vzrok za počasnejšo reakcijo cepitev v odsotnosti gvanozina pa je, da hidroksilni ioni niso zmožni tako močnih interakcij, da bi ustvarili optimalen napad. Kljub odsotnosti gvanozina pa se intron razcepi na istih mestih.
Molekula RNA je precej stabilna in fosfodiestrske vezi se v nekatalizirani reakciji cepijo zelo počasi. Ciklična oblika introna pa reakcijo pospeši dovolj, da se čas njenega poteka skrajša z 19000 let na 1 minuto.

Razdelitev intronov
Obstajata 2 vrsti razvrščanja intronov. Prva jih razvršča v štiri skupine glede na nukleotidna zaporedja intronov, druga, za nas bolj pomembna, pa v 2 skupini.
Skupina I: rRNA, mRNA, tRNA introni iz mitohondijev in kloroplastov različnih vrst (enoceličarjev, gliv in višjih rastlin)
Skupina II: RNA iz mitohondrijev gliv in kloroplastov rastlin (manj pogosta).

Introni I. skupine
Imajo 4 skupna nukleotidna zaporedja po 10 nukleotidov. Ta zaporedja imajo ključno vlogo pri 3-D strukturi introna, ki omogoča izrezovanje. Dejstvo da se je nukleotidno zaporedje ohranilo tako v jedrih, kot v mitohondrijih ter pri vrstah, ki si niso v sorodu skozi evolucijo pa kaže, da ima pomembno funkcionalno vlogo.
Izkazalo se je, da je izrezovanje introna le en korak v katalitski kaskadi reakcij, ki jih izvede RNA. Na kratko: Takoj po odstranitvi RNA se 414 nukleotidov dolg intron spremeni v krožno obliko in pri tem izgubi 15 nukleotidov. Nato se odpre v linearno obliko, zopet ciklizira in izgubi še 4 nukleotide. Molekula se ponovno odpre, tak intron pa se imenuje L-19 IVS. Tako izrezovanje so odkrili pri intronih skupine I. za reakcijo je potreben GTP. Pri analizi nukleotidnega zaporedja introna so na začetku našli ostanek gvanozina, ki v DNA ni bil kodiran. Hkrati pa so z radioaktivnim GTP potrdili, da se gvanozin ne porablja kot vir energije. Na podlagi teh opazovanj so znanstveniki zaključili, da ima GTP vlogo napadajoče skupine, ki cepi RNA na pravih mestih (fosfodiestrska vez med sladkorjem in fosfatom na 3 in 5 koncu) in s tem sproži avtoizrezovanje.






Razlaga slike:
1. Ko prosta molekula gvanozina pride v stik z intronom pre-RNA, se prične proces izrezovanja.
2. Na 1. mesto take RNA se začasno veže gvanozin. OH v gvanozinu se postavi v najboljšo pozicijo za napad na fosfatno skupino med eksonom in 5 koncem introna. Sočasno 2. vezavno mesto drži konec eksona in s tem izpostavi fosfatno vez za napad gvanozina.
3. Natančna zgradba 1. vezavnega mesta z gvanozinom še ni znana, drugo vezavno mesto za konec eksona pa so že odkrili: intron nosi zaporedje šestih nukleotidov (GGAGGG), ki se prek H-vezi povežejo s šestimi pirimidinskimi bazami (CUCUCU) na 5` koncu eksona. Intron istočasno zagrabi 6 pirimidinskih baz in gvanozin ter postavi zvito RNA v pozicijo za napad gvanozina. Objekt njegovega napada je vez med končnim U 5` eksona in sosednjim A na začetku introna. Gvanozin razcepi vez med U in A tako da se veže na A. Tako zamenjavo fosfodiestrskih vezi imenujemo transesterifikacija.
4. Ko se gvanozin priključi na konec introna, ostane 3` konec eksona za trenutek prost. Takoj sledi druga transesterifikacijska reakcija: OH skupina na eksonu napade 3` konec introna ter tako izreže intron, eksona pa združi v enotno molekulo.
5. Tretja tovrstna reakcija spremeni intron v krožno obliko.
6. Ko se zanka zapre se odcepi veriga 15 nukleotidov, ki nosijo aktivirani fosfat z OH.
7. Ta inducira odpiranje verige.
8., 9. Pojavi se še zadnje aktivirano vezavno mesto, kjer se izrežejo še 4 nukleotidi tik pred začetnim 6-nukleotidnim purinskim zaporedjem (4. transesterifikacija – ponovni obroč).
10. Intron se ponovno deciklizira, nastane intron L-19 IVS.

Introni II. skupine
Pri nadaljnjih raziskavah so odkrili, da se lahko izrezujejo tudi introni skupine II. Mitohondrijski prekurzor mRNA skupine II lahko odstrani svoj intron, vendar pa je način delovanja drugačen kot pri skupini I.
Za reakcijo niso potrebni gvanozin ali prosti nukleotidi. 5 konec se poveže z nukleotidom, ki ni zadnji in tako oblikuje zanko (lariat), ki je primeren za izrez. Lariat so odkrili pri izrezovanju intronov jedrne prekurzorske mRNA že prej, vendar so predvidevali, da ga katalizirajo proteini. Njegovo odkritje v avtoizrezovalnih intronih skupine II pa nakazuje, da imajo ribocimi vlogo tudi pri urejanju mRNA v jedru.

Razlaga slike:
1. Intron se zvije, tako da je OH skupina v položaju za napad na cepitveno mesto.
2. 5 konec introna se združi z nukleotidom v bližini 3 konca - tako nastane 2-5 fosfodiesterska vez z adenozinom, ki mora tvoriti 3 fosfodiesterske vezi.
3. OH skupina ostane vezana na lariatu, ki se sprosti, ko se eksonska dela združita.

Pravi encim
Čeprav je bilo dokazano, da ima avtoizrezovalna RNA mnogo encimskih lastnosti, je še vedno obstajala bistvena razlika; dejstvo, da ribocim raje deluje sam na sebi kot na drugih molekulah in se takoj po reakciji spremeni. Z odkritjem encima ribonukleaze P, ki je prisoten tako v bakterijah kot v višjih celicah, pa so končno našli RNA, ki deluje kot pravi encim. Ribonukleazo P so našli v Escherichia coli in Bacillus subtilis. Sestavljena je iz RNA (5x več) in proteinskega dela, njena naloga pa je, da razcepi pre-tRNA v zrelo tRNA. Deluje katalitično in se v reakcijah ne spreminja. Encim v celičnih pogojih sicer rabi proteinski del, s poskusi pa so dokazali, da in vitro RNA del sam lahko cepi pre-tRNA na pravem mestu, sam proteinski del pa tega ni zmožen.
Nadaljnje raziskave so pokazale, da tudi skrajšana oblika RNA Tetrahymena thermophila lahko deluje kot pravi encim, saj imata obe ciklizaciji enako osnovno obliko – 5` konec se odcepi in veže, transesterifikacija pa združi ostanek v zanko. Ostati pa mora ravna veriga pirimidinov, ki so pripeti na vezavno mesto. Po dveh ciklizacijah se RNA ne more več ciklizirati, ker so bili vsi za vezavo primerni pirimidini odcepljeni z 19 nukleotidi. S tem da postane ravna pa ne izgubi svoje encimske aktivnosti. Nastalemu intronu L-19 IVS so dodali kratko verigo pirimidinov C in ta jih je bil sposoben razrezati in združiti, kot je to delal prej pri samem sebi. L-19 IVS je reakcijo zapustil nespremenjen, kar ustreza definiciji pravega encima.

RNA iz RNA
Zgoraj navedeno spoznanje, da RNA lahko razreže in združi verigo pirimidinov, je velikega pomena, saj je RNA polimerizacija predpogoj za podvojevanje RNA genov, kar štejemo za temeljni izvor življenja. Odkritje, da lahko intron sintetizira RNA, nam dokazuje, da je RNA sama, brez pomoči funkcionalnih proteinov, sposobna katalizirati svoje podvojevanje.

Povzetek
• Genski zapis znotraj gena ne poteka zvezno. Del gena, ki nosi zapis za AK v polipeptidu se imenuje ekson, nekodirajoči odseki pa so introni. Ti se pri transkripciji izrežejo iz pre-mRNA in tako se oblikuje funkcionalna mRNA molekula.
• Do sedaj je veljalo, da so encimi samo proteini, v zadnjih letih pa so znanstveniki ugotovili, da lahko vlogo encima prevzame tudi RNA.
• Prvi primer katalitske aktivnosti RNA je bil odkrit pri proučevanju RNA molekule praživali Tetrahymena thermophila, izraz za tako encimsko RNA pa je ribocim.
• RNA intron Tetrahymene se izreže sam, brez prisotnosti encimov. Za izrezovanje so nujno potrebeni gvanozin in Mg ioni.
• Introne delimo v dve skupini, ki različno cepita RNA: introni skupine I in introni skupine II. Intron skupine I se takoj po izrezu ciklizira, intron skupine II pa se oblikuje v t.i. lariat (podobno lasu).
• Tudi ribocim mora biti v pravilni 3-D obliki, da lahko deluje. Za razliko od pravih encimov pa deluje sam nase in torej iz reakcije pride spremenjen.