Sinteza NO
Nastaja z delovanjem encimov, NO sintaz, oz. NOS. Te sintaze pretvorijo L-arginin v L-citrulin, vmes nastane še NO. Kot substrat za nastanek dušikovega oksida se uporabita molekularni kisik in dušik iz L-arginina. NADPH služi kot donor elektronov, kot kofaktorji pa sodelujejo še FAD, FMN, hem, tetrahidrobiopterin in pa Ca2+/kalmodulin kompleks.



Poznamo pa več tipov NO-sintaz in sicer tri glavne tipe (nevrosko ali tip I, inducibilno ali tip II (tudi makrofagna) ter endotelno ali tip III:
• Tip I NOS ali nevronska NOS je izoencim prisoten v nevronih v centralnem in tudi v perifernem živčevju. Dušikov oksid, ki nastane kot posledica delovanje NOS I, deluje kot nevrotransmiter. NOS I aktivira kalmodulin ob povišani intracelularni koncentraciji kalcija. Se pravi, da je kalcij regulator nastanka NO, čeprav se regulira sinteza NO tudi z uravnavanjem ekspresije genov za NOS.
• Tip II NOS ali inducibilna NOS je prisotna predvsem v makrofagih in gladkih mišicah, ni odvisna od kalcija in je aktivirana s kalmodulinom že pri bazalnih koncentracijah kalcija. Pomembna je pri delovanju imunskega sistema.
• Na tip III NOS, prav tako kot na NOS I, vpliva povečana intracelularna koncentracija kalcija v kompleksu s kalmodulinom. NOS III je z razliko od drugih membransko vezan.





NO pa lahko nastane v telesu tudi brez delovanja encimov npr. v želodcu, v srcu (ishemija).
Kemijske in biokemijske lastnosti NO

Je dvoatomski radikalni plin. Če ga primerjamo z drugimi radikalnimi molekulami (hidroksilni, superoksidni anion), je relativno nereaktiven. NO je zelo difuzibilen in pride do vsake lokacije v celici in tkivih zaradi lastnosti, kot so nizka molekulska masa, hidrofobnost in topnost. Vendar se to v praksi ne zgodi, ker NO, še preden pride daleč, reagira ponavadi s superoksidnim anionom. Velikokrat reagira tudi s hemoglobinom, cisteinom in serumskim albuminom. Vezava NO na albumin je fiziološko pomembna, ker je dušikov oksid vezan na albumin dokaj stabilen. To pa pomeni, da lahko deluje dalj časa in dlje od mesta nastanka. Drugače deluje parakrino in avtokrino.
Biokemijske interakcije. Na delovanje NO je občutljivih veliko snovi v telesu, med njimi tudi proteini, ogljikovi hidrati, lipidi in nukleinske kisline. Večinoma NO deluje kot inaktivator razen v primeru gvanilatne ciklaze, ki jo NO aktivira in a tem posledično cGMP. Dušikov oksid je lahko za celice tudi toksičen, če reagira z DNA, z lipidi ali proteini.
V proteinih reagira NO s kovinami. NO tako lahko med drugim inhibira delovanje nekaterih encimov npr. v dihalni verigi. Zato je potrebno količino NO v celici nadzirati. En primer je kontrola sinteze v receptorjih v možganih, kjer povečana koncentracija NO onemogoči vstop Ca2+ in s tem vstavi lastno sintezo.


Ciklični GMP

Sinteza

cGMP sintetizirajo gvanilatne ciklaze. Poznamo dve večji družini teh ciklaz:

• Gvanilil ciklazni receptorji. Polipeptid je transmembranski receptor z ektracelularno domeno, na katero se veže ligand, transmembranski -heliks in intracelularno domeno, ki ima encimsko funkcijo. Nekateri ligandi, ki aktivirajo ciklazo so atrijski natriuretični peptid, natriuretični peptid CNP, ki deluje kot nevrotransmiter ter gvanilin, ki se veže na tip C gvanilatne ciklaze v črevesnem epiteliju (veže se lahko tudi enterotoksin Escherichiae coli). Poznamo še mrežnični tip GC, ki pa veže rekoverin.
• Topne gvanilil ciklaze. So dimer dveh verig (,) in obe imata katalitsko funkcijo. Glavni katalitski center v tej ciklazi je Mn2+. Glavni stimulator encima je NO, ki poveča kcat tudi do 200x, s tem da verjetno deluje na hem prostetično skupino v encimu, ki pa je le inducibilna in ne funkcionalna domena. Obstajajo različice topnih gvanilil ciklaz, ki se lahko vežejo na membrano, verjetno zato, da je sinteza cGMP specifično lokalizirana.




Tarčni proteini cGMP-ja

cGMP deluje načeloma na 3 načine (na proteinske kinaze, ioske kanale in fosfodiesteraze).
Proteinske kinaze odvisne od cGMP. Proteinske kinaze, ki so odvisne od cGMP, se imenujejo tudi G-kinaze in so lahko topne ali membransko vezane. Ena izmed njih je topna GK-I kinaza, ki je najbolj pogosta v trombocitih, gladkomišičnih celicah in cerebelarnih Purkinje nevronih, najdemo jo lahko tudi drugje. Druga različica je GK-II, prisotna je v tankem črevesu in je membransko vezana.
cGMP-odvisni ionski kanali. Poznamo več kationskih kanalov, ki so odvisni od cGMP, kot naprimer kationski kanal v mrežnici in olfaktorni kationski kanal. Ti kanali imajo enojno regulatorsko cGMP mesto, ki dovoli prehod Ca2+.


Fiziološke funkcije regulirane z cGMP

Relaksacija gladkih mišic. Relaksacijo lahko dosežemo na katerikoli način, ki ovira fosforilacijo lahke regulatorne miozinske verige. cGMP se vmeša pri povečanju koncentracije kalcija, ki je potreben za kontrakcijo. Aktivira GK-I kinazo, ki fosforilira Ca2+-ATP-azo in jo s tem inaktivira; tako je prenos kalcija v celico onemogočen.



Inhibicija trombocitov. Trombociti se aktivirajo ob delovanju ADP in trombina, kjer je potreben tudi kalcij. Dušikov oksid iz celic sosednjih tkiv in endotelija žil in pravtako eksogeni nitrovazodilatatorji inhibirajo aktivacijo trombocitov z zniževanjem koncentracije kalcija.
Druge funkcije. V debelem črevesu je cGMP vpleten v procese sekrecije in ponovne adsorbcije ionov. Sintezo cGMP v kolonu stimulira gvanilin in tudi enterotoksin npr. iz Escherichiae coli.

Povezave NO/cGMP z drugimi signalnimi potmi

cAMP. Pot NO/cGMP se z cAMP-jem povezuje pri kontroli različnih fosfodiesteraz npr. pri toku kalcija skozi kanale v srčni mišici.


Fiziološke funkcije in klinične korelacije delovanja NO in njegovih poti

V možganih NO posledično modulira več funkcij od npr. obnašanja, se pravi višjih možganskih funkcij pa vse do delovanja prebave.

Najbolj znana vloga NO je vazorelaksacija. Tako se v telesu uravnava krvni tlak in preprečuje formacija trombusov, ker dušikov oksid širi žile in onemogoča delovanje trombocitov. Tu je zelo pomemben v medicini, ker zamašene žile npr. v srcu producirajo manj NO, ki ga lahko z nitroglilcerinom, ki je donor NO, nadomestimo in s tem povečamo pretok in posledično zmanjšamo ali preprečimo ishemijo in nekrozo tkiva.

Dušikov oksid je pomemben tudi pri infekcijah z bakterijami, ker deluje citotoksično in jih uničuje, prav tako tudi nekatere parazite. Deluje tudi vnetno, tako da ojača delovanje ciklooksigenaz, kar vodi do povečane produkcije eikozanoidov. Do problema pa lahko pride pri hujših infekcijah, kjer npr. levkociti v krvi sproščajo velike količine NO in histamina. Takrat lahko, zaradi prevelike vazodilatacije zaradi NO in večje prepustnosti žil zaradi histamina, pride do septičnega hipovolemičnega šoka.

Veliko vlogo ima dušikov oksid tudi pri regulaciji apoptoze, katero lahko pospešuje ali zavira. Zavira jo predvsem pri levkocitih, hepatocitih, tromboblastih in epitelijskih celicah.

Dušikov oksid je tudi glavni krivec za nastanek erekcije. NO povzroča nastanek cGMP pod vplivom spolnega vzdraženja. cGMP dilatira žile, s čimer se poveča dotok krvi. Zaradi tesne fascije, ki ovija penis, pa se stisnejo vene, kar prepreči odtok krvi - to povzroči erekcijo. Istočasno pa nastaja fosfodiesteraza 5 (PDE-5), ki degradira cGMP, in dokler je koncentracija še cGMP dovolj velika, PDE-5 ne prevlada in erekcija je konsistentna. To so izkoristili tudi, ko so razvili Viagro, ki blokira delovanje PDE-5, tako da se cGMP ne degradira.



Viri

- Society for experimental biology, 1996
- spletna stran St. Georges hospital Medical School, University of London
- zbornik Praškega kongresa o vlogi NO v medicini in biokemiji
- The New York Times
- Bioscience; 1. oktober, 2001 (Torreilles)
- The Cell – a molecular approach, Cooper 2000