Imunoterapija pri zdravljenju kokainske odvisnosti (2003-04-17)

Datoteke:
DatotekaVelikost
Snemi datoteko (seminar.doc)seminar.doc326 kB
IMUNSKI SISTEM


Imunski sistem sesalcev je eden najbolj bogatih virov specifičnih receptorskih molekul. Primarna naloga protiteles oz. globularnih proteinov je vezava z antigeni. Antigeni so katerekoli tuje substance, ki vdrejo v naš organizem (sladkorji, hormoni, lipidi, različne makromolekule). Protitelesa imajo zelo različne afinitete do antigenov, v najbolj ugodnih primerih pa so te lahko reda 109-1012.

Sam nastanek protiteles lahko sprožijo različne antigenske determinante. To so male regije, ki povzročajo produkcijo specifičnih protiteles, na katere se antigen veže. Tak odgovor je osnova obrambnega sistema organizma. Vsak človek lahko potencialno proizvede okoli 108 različnih struktur protiteles v procesu somatske mutacije.

Nekatere snovi pa so zmožne povzročiti nastanek protiteles le, če so pri tem kovalentno vezane na primeren nosilec, običajno beljakovino. Te molekule imenujemo hapteni. Z vezavo na nosilec delujejo kot antigenska determinanta, vendar pa same po sebi ne morejo povzročiti nastanka protiteles, kljub temu pa z njimi reagirajo.

Poznamo pa tudi snovi, ki sprožijo imunski odziv le pri nekaterih živalskih vrstah, kar pomeni, da so nekatere bakterije in virusi, ki so pogubni za eno, popolnoma neškodljivi za drugo vrsto.


Zgradba protiteles


Spadajo v imunoglobulinsko superdružino (sem spadajo še številni membranski proteini, ki pa običajno ne tvorijo povezav z antigeni). Protitelo je sestavljeno iz več polipeptidnih verig. Izdelujejo jih t.i. T-limfociti (nastajajo v timusu) in B-limfociti (nastajajo v kostnem mozgu).

Vsaka molekula ima obliko črke Y in je sestavljena iz dveh lahkih in dveh težkih verig. Posamezna veriga je sestavljena iz linearno ponavljajočega se zaporedja 110 aminokislin. V težki verigi so štiri zaporedja, v lahki pa le dva.

Vsako od teh ponavljajočih zaporedij se z drugimi povezuje preko disulfidnih cisteinskih mostičkov.

Lahki verigi sta vedno na posamezni imunoglobulinski molekuli identični, in sicer bodisi v lambda ali kapa obliki. Glede na obliko težke verige pa ločimo alfa, gama, mi, epsilon in delta verigo. Glede na to poznamo več vrst imunoglobulinov (IgM, IgA, IgE, IgD in IgG).

Vsaka od obeh verig ime kostantno (lahka eno, težka tri) in variabilno (lahka in težka po eno) regijo. Največjo variabilnost ima aminoterminalni segment.

Na vsakem protitelesu sta dve vezavni mesti za antigene.

























Na sliki: Zgradba imunoglobulinske molekule

ENCIMATIKA


Veliko kemijskih reakcij je počasnih in neselektivnih. V naravi so takšni procesi pogosto pospešeni z biološkimi katalizatorji - encimi. Le tako je omogočen kompleksen metabolizem v živih bitjih.

Encim deluje tako, da omogoča potek reakcije z manjšo aktivacijsko energijo. Substrat je molekula, ki se preko svojega aktivnega mesta veže na encim. Katalitična reakcija ima še različne katalitične intermediate (Encim-Substrat, Encim-Produkt). Primer reakcije:

Encim + Substrat -> Encim-Substrat -> Encim-Produkt -> Encim + Produkt

Substrat in produkt sta stabilni molekuli, zato je njuna prosta energija relativno nizka. Za tvorbo intermediata pa mora sistem premagati določeno energijsko bariero.









Na sliki:
Hidroliza kokaina





Za pretvorbo iz substrata v produkt morajo molekule premagati energijsko bariero ali aktivacijsko energijo. To je razlika med energijo v osnovnem stanju substrata in energijo prehodnega stanja. Višja kot je aktivacijska energija, počasnejša je reakcija.

Hitrost reakcije lahko povečujemo z:
• večanjem koncentracije molekul, ki tako v večjem številu premagujejo energijsko bariero
• višanjem temperature, vendar lahko previsoka temperatura povzroči denaturacijo proteinov pri živih organizmih
• dodajanjem encimov

Encim znižuje aktivacijsko energijo s pomočjo šibkih, nekovalentnih vezi s substratom. To daje kompleksu vezavno energijo. Vsota aktivacijske energije in vezavne energije pomeni znižano energijsko bariero in s tem hitreje potekajočo encimsko katalizirano reakcijo.

Žal pa še vedno ostajajo mnogi encimi za pomembne reakcije nedostopni za preučevanje in sintetiziranje. Za to obstaja več razlogov. Bodisi so nestabilni, bodisi za določeno reakcijo sploh ne obstajajo v primerni obliki, ali pa jih je težko izolirati.

Zaradi naštetega ima znanost velik interes razviti osnovne načine za pridobivanje proteinskih molekul s katalitičnimi in specifičnimi lastnostmi. Ko bodo povsem pojasnjena pravila zvijanja proteinov, bo možna priprava polipeptidov z linearno strukturo, ki se bodo oblikovali v značilno 3-dimenzionalno strukturo, ki je pomembna pri katalizi reakcij. Točna povezava med strukturo in funkcijo pa žal zaenkrat še ni pojasnjena.

Katalitična protitelesa


Zaradi omenjenih razlogov ostaja mnogo encimov za pomembne reakcije nedostopnih. Zato sta se pričela razvoj in proizvodnja katalitičnih protiteles, ki temeljijo na podobnosti med zgradbo encimov in protiteles.

Prvi je sorodno zgradbo encimov in protiteles opazil Linus Pauling. Ugotovil je, da so med omenjenimi mnoge podobnosti, ki se kažejo predvsem v podobni velikosti in oblikah aktivnih mest. Oboji tvorijo vodikove vezi, med njimi pa delujejo elektrostatske, disperzijske in hidrofobne interakcije.

Na sliki: Linus Pauling
1901 - 1994


Vendar pa se pomembna razlika med encimi in protitelesi kaže v tem, da protitelesa za razliko od encimov ne pospešujejo kemijskih reakcij, ampak se le vežejo na svoje ligande.

Pauling je tudi ugotovil, da je imunoglobulinsko vezavno mesto tako na encimu kot na protitelesih komplementarno vezavnim mestom na substratu. Razlika je v tem, da se protitelesa vežejo na molekule, ki so v osnovnem (stabilnem) stanju, medtem ko encimi reakcije pospešujejo ravno s principom vezave na molekule v vzbujenem stanju, jih s tem stabilizirajo in tako pospešijo reakcijo.

Ta dejstva so pripeljala do razvoja imunoglobulinov z značilnimi katalitičnimi lastnostmi, ki so jih poimenovali kar katalitična protitelesa.
Ključnega pomena pri izdelavi takšnih protiteles je izdelava stabilne molekule, ki v strukturi posnema molekule v prehodnem stanju (Transition State Analog, v nadaljevanju TSA). TSA molekule se lahko tesno vežejo s protitelesom in s tem stimulirajo nastanek za TSA specifičnih protiteles. TSA pa je analogen prehodnemu stanju reakcije, ki jo želimo katalizirati in s tem dobimo protitelesa, ki delujejo kot stabilizatorji prehodnega stanja in s tem pospešujejo reakcijo.

Ta pristop, ki ga je predlagal William P. Jenks, je bil mogoč z razvojem laboratorijskih tehnik za proizvajanje protiteles, ki so si identična in se vežejo le z enim specifičnim antigenom. Takšna protitelesa so monoklonska.
Poznamo še poliklonska protitelesa. Ta so značilna za živa bitja, katerih imunski odgovor temelji na »ugibanju« protiteles, ki se na antigene vežejo specifično in z zelo različnimi afinitetami.


Hibridomske tehnike pridobivanja protiteles

V poznih 70ih letih prejšnjega stoletja je ta tehnika revolucionirala področje imunologije, saj omogoča pridobivanje monoklonskih protiteles v neomejenih količinah. Metoda temelji na zlitju ali somatični hibridizaciji med normalno B-celico, ki izdeluje protitelesa in mielomsko celico miši, ki ne proizvaja protiteles. Z zlitjem dobimo nesmrtne linije celic, ki izdelujejo željena protitelesa. Poimenovali so jih hibridome. Neomejeno razmnoževanje pridobijo od mielomskih celic, izdelovanje specifičnih protiteles pa od B-celic. Izdelana protitelesa so monoklonska in vsa prepoznavajo isti del antigena.


ZDRAVLJENJE ODVISNOSTI


Zasvojenost s kokainom je dandanes v svetu pereč problem. V združenih državah Amerike je težkih odvisnikov nekaj več kot dva milijona , torej celotna populacija naše države, tem pa je potrebno prišteti še dodaten milijon odvisnikov v Evropi. Posledice uporabe droge segajo od hudih psiholoških motenj pa vse do nenadnega srčnega napada in nenazadnje smrti, ki je največkrat posledica prevelikega odmerka oz. overdose-a. Poleg tega, da trpijo posamezniki, je na izgubi tudi družba, saj je droga uničila celotna mesta s tem, ko je izčrpala tako ljudi kot tudi kapital, ki bi ga bilo možno uporabiti v koristne namene. K takšni razširitvi droge je botrovalo večje število dejavnikov, med drugim vse boljša dostopnost, vse večje družbeno sprejemanje uporabe drog kot normalnega pojava ter izboljšanje kvalitete droge same, ki je na razpolago tudi že v obliki prahu (crack), ki ga je možno kaditi in ima podobno učinkovitost kot intravenska indukcija. Droga nas je premagala na dveh frontah: najprej smo izgubili v boju proti njej kot družba, ker nismo znali ustaviti njenega razširjanja, po drugi strani pa tudi nismo prišli do zdravila za tiste, ki so že odvisni. Kljub desetletnim raziskavam namreč še nikomur ni uspelo odkriti kakršnegakoli zdravil, ki bi pomagalo pri odvisnosti ali pa pri samem pretiranem odmerku. Zakaj je temu tako, bomo spoznali v nadaljevanju. Na podlagi znanja o delovanju kokaina, se namreč odpirajo nova obzorja za raziskave.


Delovanje kokaina


Vse droge, ki povzročajo odvisnost, delujejo po istem principu in sicer tako, da aktivirajo limbokortikalni del možganov, ki nadzoruje naša osnovna čustva in obnašanje. Vklopijo se (dodatne) nevronske poti, t.i. reward pathways. Te poti se v normalnih okoliščinah odražajo kot zadovoljstvo oz. užitek. Vse dogajanje se odvija v sinapsah. V teh nevronskih stikih se signal prenaša tako, da en nevron odda nevrotransmiterje kot so npr. acetilholin v motorični ploščici in dopamin v našem primeru, drugi nevron pa jih sprejme na receptorjih, kar se v njegovi notranjosti odrazi kot prenos signala naprej oz. depolarizacija ali hiperpolarizacija (odvisno od stika). Droge, kot je npr. heroin, nadomeščajo nevrotransmiterje in se v sinapsah z visoko afiniteto vežejo na receptorje. Signal je tako ojačan. Poleg tega pa te snovi vplivajo na produkcijo nevrotransmiterjev, kar, poleg želje po obnovitvi občutka, ki ga povzročajo, vodi v odvisnost.

Delovanje kokaina pa se razlikuje od zgoraj omenjenega. Ta namreč deluje tako, da stikala na teh poteh ne le aktivira, temveč jih zadrži v vklopljenem položaju. Ponavadi sinapsa deluje tako, da kontrolira intenziteto signala tako, da prvi nevron s pomočjo aktivnih prenašalcev sproti odstranjuje transmiter oz. signalno molekulo z receptorjev sosednjega nevrona. Kokain pa se vmeša ravno v delovanje tega sistema, ker z vezavo na aktivne proteinske prenašalce onemogoči odstranitev dopamina z receptorjev v sinapsi in tako povzroči pretirano ojačitev signala oz. pretirano stimulira zgoraj omenjene nevronske poti. Za doseg svojega cilja uporabi že prisotne nevrotransmiterje. Posledica je podobna kot pri vseh ostalih drogah, le da lahko delovanje kokaina celo okvari sinapse, kar se kaže v srčnih zastojih, aritmijah in nenadni smrti. Zdravljenje oz. odprava posledic sta prav zaradi navedenega tako zahtevna.


Na sliki: Struktura kokaina

Druge droge je mogoče ustaviti na zelo enostaven način. V telo se uvede snov, ki se veže na receptorje in tako onemogoči vezavo npr. heroina. Medtem ko to pri kokainu ne predstavlja rešitve. Vsakršna snov, ki naj bi kokainu onemogočila vezavo na svojo tarčo, torej prenašalni protein, bo po vsej verjetnosti poškodovala tudi tega, tako da bo učinek enak kot pri sami uporabi kokaina. Raziskave v (tej) smeri blokiranja blokatorja zato ne obetajo nič dobrega. K sreči so odkritja v zadnjem času prinesla novo upanje. Razmislek je bil takle: Če ni mogoče ustaviti delovanja kokaina v možganih, bi bilo dobro kokainu onemogočiti, da do možganov in svojih tarč sploh pride. Ne glede na to, kako pride kokain v telo, je pot do možganov samo ena, to je s krvjo. V krvi pa vse tuje molekule prepoznajo in odstranijo protitelsa, ki imajo lahko tudi encimsko aktivnost . Rešitev je torej potrebno iskati v tej smeri.


Uporaba katalitičnih protiteles


Od ideje za uporabo katalitičnih protiteles, ki bi kokainu preprečila dostop do možganov, pa tja do prvih poizkusov ni daleč. Kokain se je zdel dober kandidat, saj lahko s pomočjo encimske reakcije razpade na dva čisto nedolžna produkta: Ecgonin metil ester ter benzojsko kislino. Že leta 1974 je Charles R. Schuster pri raziskavah o heroinu odkril, da lahko z uvajanjem analoga oz. drogi podobne molekule v opičje telo izzove imunski odziv (telo bo začelo producirati protitelesa za ta specifičen antigen) in s tem zmanjša učinek droge. Poleg tega so v poznih osemdesetih uspeli sintetizirati prva protitelesa, ki so imela poleg sposobnosti vezave na antigen tudi katalitično aktivnost. In nenazadnje, ta protitelesa se ob prvi vezavi na svoj antigen in njegovi razgradnji niso izčrpala, temveč so svojo zmožnost delovanja ohranila tudi po večjem številu reakcij, kar pomeni, da bi zadoščala majhna količina protiteles za inaktivacijo večje količine v telo uvedene droge.

Prvi korak je bilo spoznavanje učinkovitosti delovanja katalitičnih protiteles. Ta v večini primerov vodijo počasne reakcije in so torej manj učinkovita od naravnih encimov, ravno tista pa, ki imajo esterazno aktivnost (cepijo estersko vez, ki je v kokainu prisotna) so po svojih zmogljivostih primerljiva z encimi.

Naslednji izziv je bila sinteza kokainskega analoga, ki bi ga potem vbrizgali v telo živali. V njej bi snov sprožila imunski odziv, protitelesa pa bi z že opisanimi tehnikami lahko prečistili in delujoča producirali v velikih količinah. Vendar pa je bilo potrebno sintetizirati tak analog, ki ne bo posnemal kokaina v njegovi osnovni obliki, temveč v prehodni obliki, ki jo ta zavzame sredi reakcije v aktivacijskem kompleksu v povezavi z encimom ali v našem primeru protitelesom. To pa zato, ker aktivna mesta na protitelesu niso oblikovana za reakcijo s substratom v prvotni konformaciji, temveč v zgoraj omenjeni oz. prehodni. Lastnost, ki jo protitelo s pridom uporabi, da substratu inducira prehodno konfiguracijo in tako poveča verjetnost za uspešnost reakcije. Uspešen analog so našli. Ta je vseboval močno negativno nabito tetraedrično strukturo fosfo-monoesterske vezi, za stabilizacijo molekule pa so nanjo vezali dolgo verigo. Pridobljeni TSA-1 (transition state analogue 1) je bilo potrebno nadalje vezati na prenašalni protein, saj tako majhne molekule same po sebi ne odzovejo imunskega odziva (zato npr, nismo imuni na aspirin).

Rezultat dela sta bili dve zelo uspešni protitelesi imenovani Mab3B9 in Mab6A12. Ti sta kokain vezali, ga razgradili in reakcijo večkrat ponovili. Od tedaj so razvili še dva kokainska analoga, tako da je zdaj znanih že vsaj devet protiteles, ki uspešno razgrajajo kokain. Vsako od teh lahko razgradi več kot dve molekuli kokaina na minuto. To seveda za uporabo pri ljudeh še ni dovolj. Cilj je sinteza takih protiteles, ki bi kokain razgrajevala s frekvenco dva na sekundo, tako da bi 500mg protiteles, ki bi jih vbrizgali v pacienta, ustavilo večjo dozo kokaina na svoji poti do možganov. Ker so že bila odkrita določena protitelesa, ki so zmožna do 40 reakcij na sekundo, se zdi verjetno, da bodo našli podobna tudi za kokain.





Zaključek


Cilju boja proti kokainu se raziskovalci bližajo, a preprek na poti do zmage je še mnogo. Po sintezi dovolj dobrega protitelesa namreč ne bo dovolj uvajanje kokainskega analoga odvisnikom, ker bo telo izdelalo le majhno število katalitičnih protiteles. Le-tem bo potrebno vbrizgati čisto dozo protiteles, postopek imenujemo pasivna imunizacija, kar pomeni, da so cilj ne le analogi, temveč celične kolonije, ki imajo sposobnost izdelati specifično protitelo. Vendar to z monoklonsko proizvodnjo protiteles ne bi smel biti problem.

Bolj težavna bo izdelava takih protitels, ki bodo v telesu zdržala veš tednov, da bi v tem času odvisnik lahko začel s programom odvajanja na podlagi svetovanja in metadonskega zdravljenja ter ga ne prekinil. Na žalost se večina odvisnikov, ki se zdravi, po terapiji vrne k drogi, tako pa bi jim bilo to preprečeno, saj droga nanje ne bi imela nikakršnega učinka.

Čeprav nam morda ne bo uspelo zaustaviti vsega kokaina, da bi prišel do možganov, je upanje, da bomo z zmanjšanjem učinka droge na minimum nekatere lahko pospremili na pot do ozdravitve!

You have no rights to post comments